박테리아 바이오센서를 사용한 표적 분석물 검출

초록

출처: Barber, AE, et al. 총상 잔류물의 추정 검출을 위한 새로운 박테리아 바이오센서의 준비 및 적용. J. Vis. 경험. (2019).

이 비디오는 박테리아 바이오센서를 사용하여 특정 분석물을 검출하는 방법을 보여줍니다. 분석물에 민감한 프로모터 아래에 적색 형광 단백질(RFP) 유전자가 있는 플라스미드를 운반하는 박테리아 배양물을 채취합니다. 테스트 표면을 철저히 닦은 후 물티슈의 작은 부분을 배양액에 담그고 배양합니다. 프로모터와의 분석물 상호 작용은 RFP 발현을 활성화하여 표적 분석물의 존재를 확인합니다.

프로토콜

참고: 적색 형광 단백질(RFP)을 발현하는 대장균 의 합성이 제시됩니다.

1. 대장균에서 플라스미드 데옥시리보핵산(DNA)의 제조

1. RFP 유전자와 암피실린 내성 유전자를 갖는 플라스미드를 함유한 대 장 균을 해동하고, 100μg/mL 암피실린을 함유한 루리아 국물(LB) 한천 플레이트에서 대 장균 을 37°C에서 24시간 동안 성장시킨다. 예를 들어, 합성 생물학에 사용되는 표준 생물학적 부분의 레지스트리에서 J10060 플라스미드를 사용하십시오( 재료 표 참조). J10060 플라스미드는 pBad 프로모터 영역과 암피실린 내성 유전자의 제어 하에 RFP에 대한 유전자를 포함합니다. 또는 LB 한천 플레이트에서 성장하기 전에 대 장균 (단계 3.2 참조)을 플라스미드로 형질전환합니다.
2. 표준 미니프렙 프로토콜( 재료 표 참조)에 따라 J10060 플라스미드를 포함하는 대 장균 배양액 1mL에서 DNA를 분리합니다. 다음 프로토콜의 목적은 pBad 프로모터를 제거하고 장치에 대해 원하는 프로모터로 교체하는 것입니다.
3. 플라스미드 미니프립 후 소화 준비가 될 때까지 DNA를 냉동실에 보관합니다.

2. 제한효소 소화

1. EcoRI 및 NheI 분해를 위해 미세 원심분리기 튜브에서 다음 반응을 설정합니다: J10060 플라스미드 DNA 10 μL(1단계에서 분리됨), 물 8 μL, 완충액 1 μL와 미리 혼합된 EcoRI 및 NheI 효소 각각 1 μL( 재료 표 참조).
2. 프로모터 DNA의 경우, EcoRI 및 NheI 분해를 위해 마이크로 원심분리기 튜브에서 다음 반응을 설정합니다: 어닐링된 프로모터 DNA 서열 10μL(물 8μL, 완충액 1μL와 미리 혼합된 EcoRI 및 NheI 효소 각각 1μL).
   1. 안티몬(Sb-), 납(Pb-) 또는 트리니트로톨루엔(TNT)-RFP( 재료 표 참조)의 경우 올리고뉴클레오티드를 완충액(30mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), pH 7.5; 100mM 아세테이트칼륨)에 용해시키고, 동일한 몰 농도로 배양하고, 94°C에서 2분 동안 가열하고, 실온에서 점차적으로 냉각합니다.
3. 피펫을 10μL로 설정한 상태에서 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 샘플을 혼합합니다.
4. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
5. 효소를 80°C에서 5분 동안 열 비활성화합니다.
6. 다음 단계를 준비할 때까지 소화된 DNA를 냉동실에 보관하십시오.

3. 결찰 및 변형

1. 결찰
   1. 단계 2에서 EcoRI 및 NheI로 이중 분해된 플라스미드 및 프로모터 DNA를 사용하여, 표 1 에 나타낸 반응 혼합물을 얼음 위의 미세 원심분리기 튜브에 설정하고; 마지막으로 T4 DNA 리가아제를 추가합니다. 참고: 표 1 은 표시된 DNA 크기에 대해 삽입하기 위해 1:3 벡터의 몰비를 사용하는 결찰을 보여줍니다.
   2. 위아래로 피펫팅하여 반응을 부드럽게 혼합하고 미세 원심분리기를 잠시 진행합니다.
   3. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
   4. 65°C에서 10분 동안 열 비활성화합니다.
2. 변형
   1. 마지막 얼음 결정이 사라질 때까지 20μL의 DH5-알파 유능 대장균 세포가 들어 있는 튜브를 얼음 위에 해동합니다.
   2. 세포 혼합물에 5μL의 플라스미드 DNA를 첨가합니다. 튜브를 조심스럽게 4-5번 넘겨 세포와 DNA를 혼합합니다.
   3. 혼합물을 얼음 위에 2분 동안 놓습니다.
   4. 정확히 42°C에서 정확히 30초 동안 열충격을 가합니다. 섞지 마십시오.
   5. 얼음 위에 2분 동안 놓습니다. 섞지 마십시오.
   6. 이화산물 억제(SOC)가 있는 실온 초최적 국물 380μL를 혼합물에 피펫팅합니다. 암피실린(100μg/mL)이 들어 있는 LB 한천 플레이트에 즉시 펴 바르고 37°C에서 밤새 배양합니다.
   7. 성장에 대해 24시간 이내에 플레이트를 확인하십시오.
   8. 접시를 밀봉 필름으로 밀봉하고 다음 단계를 수행할 준비가 될 때까지 냉장고에 보관하십시오.

4. 콜로니 중합효소 연쇄 반응(PCR)

1. 표 2에 표시된 반응 혼합물을 PCR 튜브(4개의 반응 튜브 설정)에 추가합니다.
2. 위아래로 피펫팅하여 반응을 부드럽게 혼합합니다.
3. 노란색 피펫 팁을 사용하여 형질전환된 대장균의 콜로니(또는 매우 작은 영역)를 긁어냅니다. 이 대장균 을 절편된 새 LB/암피실린/한천 플레이트에 스와이프한 다음 피펫 팁을 PCR 튜브에 삽입합니다. 피펫 팁을 흔들어 대장균 과 PCR 혼합물을 혼합합니다. 추가 콜로니에 대해 세 번 더 반복합니다. PCR 튜브를 PCR 기계로 옮기고 표 3에 표시된 프로그램을 사용하여 열순환을 시작합니다.
4. TAE 9Tris-Acetate-EDTA)에서 2% 아가로스 겔을 사용하여 겔 전기영동을 실행하여 어떤 콜로니가 플라스미드에 가장 잘 결찰되는지 결정하고 해당 콜로니를 새 플레이트에서 성장시킵니다.
5. 테스트 준비가 될 때까지 접시를 냉장고에 보관하십시오. 화학 테스트를 위해 100μg/mL 암피실린을 첨가한 Luria 국물에 액체 배양액을 준비합니다.

5. DNA 시퀀싱

1. 각 샘플에 대해 플라스미드 5μL, 시퀀싱 프라이머 4μL, 탈이온수 3μL를 첨가합니다.
2. 이 혼합물을 튜브에 넣고 DNA 시퀀싱을 위해 보냅니다( 재료 표 참조).
3. DNA 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 DNA 서열 데이터를 분석하여 예상 DNA 서열과 관찰된 DNA 서열을 비교하여 돌연변이가 없고 유전자가 올바르게 삽입되었는지 확인합니다.
   참고: 대장균을 화학 센서로 사용하는 방법은 다음과 같습니다.

6. 대장균 배양액의 준비

1. 액체 배양을 위해 100μg/mL 암피실린으로 LB를 준비합니다.
2. 센서 박테리아, 양성 대조군* 박테리아 및 음성 대조군** 박테리아의 액체 배양을 준비합니다.
   참고: *양성 대조군 박테리아: 구성 프로모터의 제어 하에 RFP 유전자를 갖는 플라스미드를 포함하는 대장균; 합성 생물학에 사용되는 표준 생물학적 부분 등록부의 플라스미드 E1010( 재료 표 참조)이 이 작업에 사용되었습니다.**음성 대조군 박테리아: pBad 프로모터(합성 생물학에 사용되는 표준 생물학적 부분 등록부의 플라스미드 J10060( 재료 표 참조) 또는 RFP 유전자가 없는 플라스미드와 같은 다른 프로모터의 제어 하에 RFP 유전자를 가진 플라스미드를 포함하는 대장균.
3. 배양균을 37°C 및 220rpm에서 최소 8시간, 최대 18시간 동안 진동 인큐베이터에 넣습니다. 탁한 국물은 박테리아 성장을 나타냅니다.

7. 장치의 기능을 확인하기 위해 대장균 적정

알림: 기능을 확인하기 위해 센서를 적정한 후에는 이 단계를 반복할 필요가 없습니다. 납, 안티몬 및 2,4-DNT 또는 1,3-디니트로벤젠(1,3-DNB)을 첨가한 형태의 양성 대조군은 전체 적정 없이 각 용도에 대한 장치의 기능을 확인할 수 있습니다.

1. 물에 10ppm 농도로 관심 분석물의 원액을 준비합니다. 용해도가 문제인 경우 50/50 물/메탄올 혼합물을 사용하십시오.
2. 표 4를 가이드로 사용하여 적절한 수의 멸균 배양 튜브에 라벨을 붙이고 배양된 국물 2mL(프로토콜 단계 6에서)를 각 튜브에 넣습니다.
   참고: 일반적인 분석 범위를 결정하려면 센서 박테리아로 최소 3가지 다른 수준의 분석물을 수행하고, 음성 대조군으로 1단계, 양성 대조군으로 1단계 이상을 수행합니다. 또한 금속이 첨가되지 않은 각 박테리아의 튜브가 하나씩 있어야 합니다(또 다른 유형의 음성 대조군). 분석 범위와 검출 한계를 보다 정확하게 결정하려면 더 넓은 범위의 분석물 농도를 사용하십시오.
3. 표 4에 명시된 대로 2mL의 국물이 들어 있는 튜브에 분석물 원액을 추가하고, 스냅 캡을 배양 튜브에 놓아 느슨해지도록 하고(튜브로 공기가 흐를 수 있도록) 배양 튜브를 소용돌이치게 합니다.
4. 스냅 캡을 배양 튜브에 느슨하게 두고, 220rpm 및 37°C에서 최소 24시간 동안 진탕 인큐베이터에 넣습니다.
5. 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 캡을 튜브에 단단히 끼운 다음 형광 분석이 준비될 때까지 튜브를 냉장고에 보관합니다.

8. 대장균을 총상 잔류물(GSR)에 대한 화학 센서로 사용

1. 납 제거용으로 설계된 에탄올 기반 물티슈( 재료 표 참조)를 사용하여 손가락 사이를 포함하여 손의 모든 표면을 닦습니다. 각 손에 별도의 물티슈를 사용하십시오. 분석할 때까지 물티슈를 적절하게 라벨이 붙은 밀봉 가능한 백에 보관하십시오.
2. 테스트할 표면의 경우 넓은 표면에는 알코올 기반 물티슈를 사용하고 작은 표면에는 에탄올에 적신 면봉을 사용하십시오.
   참고: GSR에 대한 센서의 반응을 보여주기 위해 사용한 .40 구경 카트리지 케이스의 내부를 에탄올에 적신 면봉으로 닦았습니다.
3. 깨끗한 장갑을 끼고 알코올로 닦은 가위를 사용하여 물티슈 중앙에서 약 1cm² 부분을 잘라냅니다.
4. 손 물티슈의 절단 조각이나 면봉을 2mL의 센서 박테리아가 들어 있는 배양 튜브에 직접 넣고 국물에 잠기도록 합니다.
5. 위의 7.4 – 7.5단계에서 설명한 대로 진행합니다.

표 1. 결찰을 위한 반응 혼합물, 프로토콜 단계 3.1.1.

구성 요소	20 μL 반응
10X T4 DNA 리가아제 완충액	2 μL
플라스미드 DNA (3 kb)	3 μL
프로모터 DNA (0.7kb)	10 μL
뉴클레아제가 없는 물	4 μL
T4 DNA 리가아제	1 μL

 

 

 

 

 

 

표 2. 콜로니 PCR을 위한 반응 혼합물, 프로토콜 단계 4.1.

구성 요소	25 μL 반응
10 μM 포워드 프라이머	0.5 μL
10μM 리버스 프라이머	0.5 μL
Taq 2X 마스터 믹스 1개	12.5 μL
뉴클레아제가 없는 물	11 μL

 

 

 

 

 

표 3. 프로토콜 단계 4.3에 대한 PCR 열순환 매개변수.

걸음	임시 직원	시간
초기 변성	94 °C	30초
30 사이클	94 °C	30초
	55 °C	45초
	68 °C	60초
최종 확장	68 °C	5 분
들다	4 °C

 

 

 

 

 

 

 

표 4. 바이오센서의 적정을 위해 설정된 일반 실험, 프로토콜 단계 7.2.

튜브 ID	박테리아	첨가된 분석물 용액의 농도(ppm)	금속 첨가	2,000 μL 국물에 첨가된 분석물 용액의 부피	[분석물], ppb
1	PbRFP	10	연	2.5	12
2	PbRFP	10	연	75	361
3	PbRFP	10	연	150	698
4	PbRFP	0	없음	0	0
5	RFP 부정	10	연	10	50
6	RFP 위치	10	연	10	50

재료