출처: Morales-Soto, N. et. al., 박테리아 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화. J. Vis. 경험. (2015년)
이 비디오는 연질 한천의 표면 운동성을 관찰하기 위해 녹색 형광 단백질을 발현하는 박테리아를 사용하는 군집 분석을 보여줍니다. 타임랩스 이미징은 조정된 팽창과 덩굴손 형성을 포착하여 박테리아 표면 운동성을 강조합니다.
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방법 논문
박테리아 표면 운동성을 시각화하기 위한 군집 분석
1.3K 조회수
⸱
2025년 9월 26일
이 논문에서
초록
프로토콜
1. 군집 분석 배지 준비 및 접종
- 미디어 준비
메모: 아래에 설명된 배지 조성은 녹농균 덩굴손 형성 연구에 적용할 수 있습니다. 녹농균, Bacillus subtilis 및 Myxococcus xanthus 표면 운동성 분석에 대한 표 1의 배지 사양을 참조하십시오.- 유동화 호기성 바이오 반응기(FAB)-마이너스 황산암모늄((NH4)2SO4) 스웜 배지(재료표) 200ml, 귀천 0.9g, 카사미노산 0.2g(표 1)을 마그네틱 교반 바로 교반하여 혼합합니다. 실험 간의 일관성을 개선하기 위해 소량(100-300ml)을 사용하십시오.
- 22분의 노출 시간, 121.1°C의 노출 온도 및 빠른 벤트 옵션을 사용하여 200ml 한천/배지 혼합물을 오토클레이브합니다. 오토클레이브 설정은 적절한 살균 및 한천 용융을 허용하지만 한천 캐러멜화는 방지합니다.
메모: 고귀한 한천은 캐러멜화되기 쉽습니다. 박테리아 운동성은 캐러멜화된 한천에서 변경됩니다. - 멸균 주기가 완료된 직후 증발로 인한 수분 손실을 방지하기 위해 미디어 병의 뚜껑을 닫으십시오. 그러나 뚜껑을 꽉 채우면 병에 "진공 밀봉"과 같은 효과가 발생할 수 있습니다.
- 실온(RT)에서 교반하면서 배지를 50°C로 냉각하고 멸균 1.2M 포도당 2ml를 첨가합니다. 또는 배지를 사용할 준비가 될 때까지(최대 15시간 후) 60°C 인큐베이터 또는 수조에 넣고 지시에 따라 진행합니다. 매체에 기포가 형성되는 것을 방지하려면 마그네틱 교반 막대를 사용하여 완전히 혼합하십시오. 한천 표면의 거품은 떼를 지어 버리는 것을 방지합니다.
메모: 다른 분석의 경우, 필요에 따라 이 단계에서 추가 영양소 또는 염료와 같이 고압멸균할 수 없는 열에 민감한 성분을 추가합니다(예: 아래 대표 결과에 표시된 바와 같이, 녹인 한천 100ml당 8μl Invitrogen Syto 63 염료를 이미지화합니다). 일부 염료의 첨가는 기본 군집 행동에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 염료가 아닌 대조군과 비교하여 확인해야 합니다. - 실험실 후드에서 직경 60mm의 폴리스티렌 페트리 접시당 멸균 배지 7.5ml를 분취하고 플레이트를 단일 층(쌓지 않음)으로 유지합니다. 더 큰 떼 표면의 경우 직경 100mm 페트리 접시 당 25ml의 배지를 분취합니다. 균일한 수평면에 접시를 채우는 것이 중요합니다. 과녁 수준기를 사용하여 표면이 수평인지 확인합니다.
메모: P. aeruginosa(녹농균 ) 분석의 경우 플레이트당 특정 배지 부피를 사용하면 일관성과 재현성이 향상됩니다. B. subtilis 및 M. xanthus 분석의 경우, 손으로 붓는 것은 특정 부피의 분취량에 필적하는 결과를 산출합니다.
- 플레이트 경화
- 작은 플레이트(60mm)의 경우, 녹은 한천 배지를 덮지 않은(즉, 뚜껑 없이) 후드에서 경화시키고(반고체 및 건조된 과도한 액체로 설정) 30분 동안 합니다. 더 큰 플레이트(100mm)는 더 긴 경화 시간이 필요합니다(설명 참조).
메모: 또는 일부 분석에서는 플레이트가 단일 층으로 덮여 있는(즉, 뚜껑을 덮은) 벤치 탑에서 밤새 (20-24시간) 경화해야 할 수 있습니다(표 1). 떼를 지어 보는 것은 과잉 수분과 불충분한 수분 모두에 민감합니다. 특정 실험실의 습도, 공기 흐름 및 온도에 따라 박테리아의 최적 떼를 촉진하기 위해 플레이트 경화의 변화가 필요할 수 있습니다. - 건조 기간이 끝난 직후 플레이트에 접종하십시오. 추가 사용을 위해 플레이트를 보관하지 마십시오.
- 0.50%(vol/vol) Higgins 방수 블랙 인디아 잉크와 박테리아 접종물의 10μl 혼합물로 테스트 플레이트를 발견하여 "잉크 확산 테스트"를 수행합니다. 잉크/접종물 혼합물이 미디어 표면에 쉽게 퍼지면(즉, 물방울 형태를 유지하지 않음) 미디어가 건조되는 데 추가 시간이 필요합니다.
메모: 습도에 특히 민감한 종(예: 녹농균)의 경우 빠른 "잉크 확산 테스트"를 수행하여 플레이트가 충분히 건조한지 확인합니다.
- 0.50%(vol/vol) Higgins 방수 블랙 인디아 잉크와 박테리아 접종물의 10μl 혼합물로 테스트 플레이트를 발견하여 "잉크 확산 테스트"를 수행합니다. 잉크/접종물 혼합물이 미디어 표면에 쉽게 퍼지면(즉, 물방울 형태를 유지하지 않음) 미디어가 건조되는 데 추가 시간이 필요합니다.
- 작은 플레이트(60mm)의 경우, 녹은 한천 배지를 덮지 않은(즉, 뚜껑 없이) 후드에서 경화시키고(반고체 및 건조된 과도한 액체로 설정) 30분 동안 합니다. 더 큰 플레이트(100mm)는 더 긴 경화 시간이 필요합니다(설명 참조).
- 군집 분석 접종
- 6ml의 국물 배양 배지(자세한 내용은 표 1 참조)에 신선한(실온에 방치하면 < 5일) 용해 원리 국물(LB) 플레이트 배양액에서 분리된 콜로니를 접종합니다. 국물 배양액을 30°C 또는 37°C에서 수평 진압(240rpm)과 함께 밤새도록 배양합니다(≤18시간).
- 1-5μl의 하룻밤 국물 배양액으로 스팟팅하거나 멸균 이쑤시개 또는 와이어 접종 바늘로 한천을 "찌르는" 방식으로 군집 플레이트를 접종합니다.
메모: 우리는 접종물이 튀를 가능성을 줄이고 군집 표면적에 추가 수분을 추가하는 것을 방지하기 때문에 후자의 방법을 선호합니다.
- 군집 분석 배양
- 일반 분석의 경우, 군집 분석 플레이트를 30°C 또는 37°C( 또는 B. subtilis의 경우 42°C; 표 1) - 이것은 박테리아 특이적입니다. 과도한 수분이 한천이 아닌 뚜껑에 응축되도록 배양하는 동안 플레이트를 뒤집습니다.
메모: 온도는 표현형과 동역학에 영향을 미칠 수 있습니다. P. aeruginosa 떼의 경우 37°C에서 배양하면 30°C에서 배양하는 것보다 더 빠른 성장과 무리 확장이 가능합니다. 그러나 이러한 떼의 형태는 이러한 온도 변화에 따라 달라지는 경우가 많습니다. - 타임랩스 이미징의 경우, 스웜 플레이트를 이미징 스테이션으로 옮기기 전에 적절한 온도에서 인큐베이팅합니다(자세한 내용은 표 1 참조).
메모: 이 사전 이미징 인큐베이션을 통해 떼는 새로운 환경으로 이동하기 전에 발달을 시작하고 자리를 잡을 수 있으며, 이는 떼 운동성에 최적일 수도 있고 아닐 수도 있습니다.
- 일반 분석의 경우, 군집 분석 플레이트를 30°C 또는 37°C( 또는 B. subtilis의 경우 42°C; 표 1) - 이것은 박테리아 특이적입니다. 과도한 수분이 한천이 아닌 뚜껑에 응축되도록 배양하는 동안 플레이트를 뒤집습니다.
2. 표면 운동성 분석의 거시적 이미징
- 타임랩스 이미징의 경우, 사전 이미징 배양 기간 후에 군집 분석 플레이트를 상업용 생체 내 이미징 스테이션 내부의 투명 이미징 플레이트에 놓습니다. 한 번에 최대 6개의 직경 60mm 또는 4개의 직경 100mm 플레이트를 이미지화합니다. 카메라는 이미징 평면 아래에서 이미지를 캡처하므로 광학 경로가 차단되지 않도록 플레이트를 반전시킵니다. 또는 실험 기간 동안 30°C 또는 37°C(표 1)에서 배양하고 설정된 시간 간격으로 인큐베이터에서 이미지화할 플레이트를 제거합니다.
- 페트리 접시의 뚜껑을 접종된 배지를 담는 접시 위에 똑바로 세웁니다. 이미징 중 과도한 건조를 방지하기 위해 페트리 접시의 뚜껑에 물을 채우고 실험 내내 습도를 유지하기 위해 다른 투명 트레이를 사용하여 전체 설정을 동봉합니다.
- 분자 이미징(MI) 소프트웨어를 사용하여 표 2에 설명된 이미징 설정을 사용하여 실온에서 분석을 실행합니다. 타임랩스 이미징의 경우 필요한 단계와 사양으로 프로토콜을 설정합니다.
표 1: 표면 운동성 분석 준비 사양. P. aeruginosa, B. subtilis 및 M. xanthus에 대한 표면 운동성 분석 준비 사양이 포함되어 있습니다.
| 녹농균 | P. aeruginosa: 덩굴손 형성 연구 | B. 서브틸리스 | M. 크산투스 | |
| 하룻밤 국물 배양 배지 | FAB 플러스 30 mM 포도당 | FAB 플러스 30 mM 포도당 | 파운드 | CTT(복합 매체) |
| 하룻밤 국물 배양 배양 온도 | 37 °C | 37 °C | 37 °C | 30°C에서 30시간 |
| 스웜 미디어 | 팹 | FAB 마이너스(NH4)2SO4 | 2%(중량/부피) LB | CTT |
| 스웜 미디어: 추가 구성 요소 | 12 mM 포도당a | 10%(wt/vol) 카사미노산(CAA), 12mM 포도당a | 해당 사항 없음 | SYTO® 64a |
| 한천 유형 | 한천, 고귀한 | 한천, 고귀한 | 과립 한천 | 한천, 고귀한 Affymetrix |
| 한천 농도(wt/vol) | 0.45% | 0.45% | 0.60% | 1.50% |
| 군집 플레이트 크기 | 60 밀리미터 | 60 밀리미터 | 100 밀리미터 | 150 밀리미터 |
| 플레이트당 용지 부피 | 7.5 ml | 7.5 ml | 손으로 부은 | 손으로 부은 |
| 군집 배지 설정/건조 방법 | 두건; 덮이지 않은 판 | 두건; 덮이지 않은 판 | 벤치탑 플레이트 덮개 | 벤치탑 플레이트 덮개 |
| 스웜 미디어 설정/건조 시간 | 30 분 | 30 분 | 하룻밤(20 -24시간) | 하룻밤(20 -24시간) |
| 군집 분석 배양 온도 | 30 또는 37 °C | 30 °C | 37 °C | 30 °C |
| 타임랩스 이미징을 위한 인큐베이션 | 30°C에서 최소 4시간 동안 | 30°C에서 최소 4시간 동안 | 37°C에서 2시간 동안 | 12시간 동안 RT |
| 타임랩스 캡처 길이 | 24 시간 | 24 시간 | 10 시간 | 66시간 |
| 타임랩스 설정 | 1 프레임/10 분 | 1 프레임/10 분 | 1 프레임/6 분 | 1 프레임/10 분 |
| a 고압멸균 후 추가됨. | ||||
표 2: 이미징 사양. 박테리아 표면 성장의 적색 및 녹색 형광 및 발광 이미징을 위한 Bruker 이미징 스테이션 사양.
| 신호 | 녹색 형광 | 적색 형광 I | 적색 형광 II | 발광 |
| 단백질 또는 염료 | 녹색 형광 단백질(GFP) | mCherry 단백질 또는 나일 레드 람놀지질 염색 | 시토® 64 | 럭스 오페론의 루시페라제 |
| 여기 파장(nm) | 480 ± 10 | 540 ± 10 | 590 ± 10 | 꺼짐 |
| 방출 파장(nm) | 535 ± 17.5 | 600 ± 17.5 | 670 ± 17.5 | 필터 없음 |
| 노출 시간(초) | 30 | 60 | 60 | 240 |
| F-스톱 | 4.0 | 4.0 | 2.5 | 1.1 |
| FOV(mm) | 190 | 190 | 140 | 120 |
| 초점면(mm) | 27.5 | 27.5 | 12.2 | 4 |
| 비닝(픽셀) | 없음 | 2 x 2 | 없음 | 8 x 8 |
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 시약: | ||||
| FAB 최소 미디어: | ~4주마다 준비하십시오. 나노퓨어 H2O로 1L까지 토핑합니다. | |||
| (NH4)2소4 | 시그마 | A4418 | 2 그램 | P. aeruginosa, 덩굴손 형성 연구에는 사용되지 않습니다. |
| Na2HPO4 x 7H2O | 시그마-알드리치 | S9390 | 9 그램 | |
| KH2PO4 | 시그마 | P5655 | 3 g | |
| 나크롬 | BDH | BDH8014 | 3 g | |
| MgCl2 x 6H2O 용액(198g/L) | 피셔 사이언티픽 | M33 | 1ml | |
| CaCl2 x 2H2O 용액(14g/L) | 피셔 사이언티픽 | C79 | 1ml | |
| 미량 금속 용액(아래 참조) | 해당 사항 없음 | 해당 사항 없음 | 1ml | |
| 미량 금속 용액: | 나노퓨어 H2O로 1L에 담아 유리병에 담아 저어주고 호일로 덮습니다. | |||
| CaSO4 x 2H2O | 시그마-알드리치 | 255548 | 200 mg | |
| MnSO4 x H2O | 시그마-알드리치 | M7634 | 20 mg | |
| CuSO4 x 5H2O | 피셔 사이언티픽 | C493 | 20 mg | |
| 아연소4 x 7H2O | 시그마-알드리치 | Z4750 시리즈 | 20 mg | |
| 코소4 x 7H2O | 시그마-알드리치 | C6768 | 10 mg | |
| 나무오4 x 2H2O | 시그마 | S6646 | 10 mg | |
| H3BO3 | 피셔 사이언티픽 | 답74 | 5 mg | |
| FeSO4 x 7H2O | 시그마-알드리치 | F7002 시리즈 | 200 mg | |
| CTT 미디어: | 필요에 따라 준비하십시오. 나노퓨어 H2O로 100ml에 얹습니다. | |||
| Tris-HCl, 1 M 용액(pH 8.0으로 조정) | 암레스코 | 234 | 1ml | 나노 순수 H2O에 1M 원액을 준비하고 pH를 8.0으로 조정하고 여과하여 멸균합니다(0.2μm 기공). |
| K2HPO4, 1 M 용액(pH 7.6으로 조정) | 시그마-알드리치 | P3786 | 0.1 ml | 나노 순수 H2O에 1M 원액을 준비하고 pH를 7.6으로 조정하고 여과하여 멸균합니다(0.2μm 기공). |
| MgSO4 용액 | 피셔 사이언티픽 | M65 | 0.8 ml | 나노 순수 H2O에 1M 원액을 준비하고 필터 멸균(0.2μm 기공)합니다. |
| 카시톤 | BD 진단 | 225930 | 1 그램 | |
| 추가 시약: | ||||
| LB 육수, 레녹스 | BD 진단 | 240230 | 2 % (중량/부피) | |
| D-(+)-포도당 | 시그마-알드리치 | 지5767 | 하룻밤 국물 배양의 경우 30mM; 스웜 미디어의 경우 12mM | 나노 순수 H2O에서 1.2M 필터 멸균 원액을 준비하고 고압멸균 후 배지에 첨가합니다. |
| 카사미노산(CAA) | 암레스코 | J851 | 0.10 % (중량 / 볼륨) | P. aeruginosa, 덩굴손 형성 연구에 권장됩니다. 고압멸균 전에 배지에 첨가하십시오. |
| 한천, 고귀한 | 시그마-알드리치 | A5431 | 0.45 % (중량 / 부피) | P. aeruginosa의 표면 운동성 연구를 위한 선호되는 Noble 한천. 고압멸균 전에 배지에 첨가하십시오. |
| 한천, 고귀한 | 아피메트릭스 | 10907 | 1.50 % (중량/부피) | M. xanthus 표면 운동성 연구에 사용됩니다. P. aeruginosa의 운동성 연구에는 권장되지 않습니다. 고압멸균 전에 배지에 첨가하십시오. |
| 한천, 과립 | 피셔 사이언티픽 | BP1423 시리즈 | 0.60 % (중량/볼륨) | |
| 히긴스 방수 블랙 인디아 잉크 | 히긴스 | HIG44201 | 0.50 % (부피/부피) | 잉크와 접종물을 혼합하여 스웜 미디어 표면 수분을 테스트합니다. |
| SYTO® 64 적색 형광 핵산 염색 | 인비트로젠 | S-11346 | 용융 한천 100ml당 SYTO® 64 4μl(P . aeruginosa의 경우) 또는 8μl( M. xanthus의 경우)(고압멸균 후 첨가)를 사용합니다. | |
| 관련 자재 및 장비: | ||||
| 페트리 접시, 멸균, 150 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-326 | ||
| 페트리 접시, 멸균, 100 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-342 | ||
| 페트리 접시, 멸균, 60 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-092 | ||
| 생체 내 Xtream | 브루커 | 표면 운동성 연구의 거시적 이미징에 사용됩니다. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html |
