박테리아 표면 운동성을 시각화하기 위한 군집 분석

초록

출처: Morales-Soto, N. et. al., 박테리아 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화. J. Vis. 경험. (2015년)

이 비디오는 연질 한천의 표면 운동성을 관찰하기 위해 녹색 형광 단백질을 발현하는 박테리아를 사용하는 군집 분석을 보여줍니다. 타임랩스 이미징은 조정된 팽창과 덩굴손 형성을 포착하여 박테리아 표면 운동성을 강조합니다.

프로토콜

1. 군집 분석 배지 준비 및 접종

1. 미디어 준비
   메모: 아래에 설명된 배지 조성은 녹농균 덩굴손 형성 연구에 적용할 수 있습니다. 녹농균, Bacillus subtilis 및 Myxococcus xanthus 표면 운동성 분석에 대한 표 1의 배지 사양을 참조하십시오.
   1. 유동화 호기성 바이오 반응기(FAB)-마이너스 황산암모늄((NH4)₂SO₄) 스웜 배지(재료표) 200ml, 귀천 0.9g, 카사미노산 0.2g(표 1)을 마그네틱 교반 바로 교반하여 혼합합니다. 실험 간의 일관성을 개선하기 위해 소량(100-300ml)을 사용하십시오.
   2. 22분의 노출 시간, 121.1°C의 노출 온도 및 빠른 벤트 옵션을 사용하여 200ml 한천/배지 혼합물을 오토클레이브합니다. 오토클레이브 설정은 적절한 살균 및 한천 용융을 허용하지만 한천 캐러멜화는 방지합니다.
      메모: 고귀한 한천은 캐러멜화되기 쉽습니다. 박테리아 운동성은 캐러멜화된 한천에서 변경됩니다.
   3. 멸균 주기가 완료된 직후 증발로 인한 수분 손실을 방지하기 위해 미디어 병의 뚜껑을 닫으십시오. 그러나 뚜껑을 꽉 채우면 병에 "진공 밀봉"과 같은 효과가 발생할 수 있습니다.
   4. 실온(RT)에서 교반하면서 배지를 50°C로 냉각하고 멸균 1.2M 포도당 2ml를 첨가합니다. 또는 배지를 사용할 준비가 될 때까지(최대 15시간 후) 60°C 인큐베이터 또는 수조에 넣고 지시에 따라 진행합니다. 매체에 기포가 형성되는 것을 방지하려면 마그네틱 교반 막대를 사용하여 완전히 혼합하십시오. 한천 표면의 거품은 떼를 지어 버리는 것을 방지합니다.
      메모: 다른 분석의 경우, 필요에 따라 이 단계에서 추가 영양소 또는 염료와 같이 고압멸균할 수 없는 열에 민감한 성분을 추가합니다(예: 아래 대표 결과에 표시된 바와 같이, 녹인 한천 100ml당 8μl Invitrogen Syto 63 염료를 이미지화합니다). 일부 염료의 첨가는 기본 군집 행동에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 염료가 아닌 대조군과 비교하여 확인해야 합니다.
   5. 실험실 후드에서 직경 60mm의 폴리스티렌 페트리 접시당 멸균 배지 7.5ml를 분취하고 플레이트를 단일 층(쌓지 않음)으로 유지합니다. 더 큰 떼 표면의 경우 직경 100mm 페트리 접시 당 25ml의 배지를 분취합니다. 균일한 수평면에 접시를 채우는 것이 중요합니다. 과녁 수준기를 사용하여 표면이 수평인지 확인합니다.
      메모: P. aeruginosa(녹농균 ) 분석의 경우 플레이트당 특정 배지 부피를 사용하면 일관성과 재현성이 향상됩니다. B. subtilis 및 M. xanthus 분석의 경우, 손으로 붓는 것은 특정 부피의 분취량에 필적하는 결과를 산출합니다.
2. 플레이트 경화
   1. 작은 플레이트(60mm)의 경우, 녹은 한천 배지를 덮지 않은(즉, 뚜껑 없이) 후드에서 경화시키고(반고체 및 건조된 과도한 액체로 설정) 30분 동안 합니다. 더 큰 플레이트(100mm)는 더 긴 경화 시간이 필요합니다(설명 참조).
      메모: 또는 일부 분석에서는 플레이트가 단일 층으로 덮여 있는(즉, 뚜껑을 덮은) 벤치 탑에서 밤새 (20-24시간) 경화해야 할 수 있습니다(표 1). 떼를 지어 보는 것은 과잉 수분과 불충분한 수분 모두에 민감합니다. 특정 실험실의 습도, 공기 흐름 및 온도에 따라 박테리아의 최적 떼를 촉진하기 위해 플레이트 경화의 변화가 필요할 수 있습니다.
   2. 건조 기간이 끝난 직후 플레이트에 접종하십시오. 추가 사용을 위해 플레이트를 보관하지 마십시오.
      1. 0.50%(vol/vol) Higgins 방수 블랙 인디아 잉크와 박테리아 접종물의 10μl 혼합물로 테스트 플레이트를 발견하여 "잉크 확산 테스트"를 수행합니다. 잉크/접종물 혼합물이 미디어 표면에 쉽게 퍼지면(즉, 물방울 형태를 유지하지 않음) 미디어가 건조되는 데 추가 시간이 필요합니다.
         메모: 습도에 특히 민감한 종(예: 녹농균)의 경우 빠른 "잉크 확산 테스트"를 수행하여 플레이트가 충분히 건조한지 확인합니다.
3. 군집 분석 접종
   1. 6ml의 국물 배양 배지(자세한 내용은 표 1 참조)에 신선한(실온에 방치하면 < 5일) 용해 원리 국물(LB) 플레이트 배양액에서 분리된 콜로니를 접종합니다. 국물 배양액을 30°C 또는 37°C에서 수평 진압(240rpm)과 함께 밤새도록 배양합니다(≤18시간).
   2. 1-5μl의 하룻밤 국물 배양액으로 스팟팅하거나 멸균 이쑤시개 또는 와이어 접종 바늘로 한천을 "찌르는" 방식으로 군집 플레이트를 접종합니다.
      메모: 우리는 접종물이 튀를 가능성을 줄이고 군집 표면적에 추가 수분을 추가하는 것을 방지하기 때문에 후자의 방법을 선호합니다.
4. 군집 분석 배양
   1. 일반 분석의 경우, 군집 분석 플레이트를 30°C 또는 37°C( 또는 B. subtilis의 경우 42°C; 표 1) - 이것은 박테리아 특이적입니다. 과도한 수분이 한천이 아닌 뚜껑에 응축되도록 배양하는 동안 플레이트를 뒤집습니다.
      메모: 온도는 표현형과 동역학에 영향을 미칠 수 있습니다. P. aeruginosa 떼의 경우 37°C에서 배양하면 30°C에서 배양하는 것보다 더 빠른 성장과 무리 확장이 가능합니다. 그러나 이러한 떼의 형태는 이러한 온도 변화에 따라 달라지는 경우가 많습니다.
   2. 타임랩스 이미징의 경우, 스웜 플레이트를 이미징 스테이션으로 옮기기 전에 적절한 온도에서 인큐베이팅합니다(자세한 내용은 표 1 참조).
      메모: 이 사전 이미징 인큐베이션을 통해 떼는 새로운 환경으로 이동하기 전에 발달을 시작하고 자리를 잡을 수 있으며, 이는 떼 운동성에 최적일 수도 있고 아닐 수도 있습니다.

2. 표면 운동성 분석의 거시적 이미징

1. 타임랩스 이미징의 경우, 사전 이미징 배양 기간 후에 군집 분석 플레이트를 상업용 생체 내 이미징 스테이션 내부의 투명 이미징 플레이트에 놓습니다. 한 번에 최대 6개의 직경 60mm 또는 4개의 직경 100mm 플레이트를 이미지화합니다. 카메라는 이미징 평면 아래에서 이미지를 캡처하므로 광학 경로가 차단되지 않도록 플레이트를 반전시킵니다. 또는 실험 기간 동안 30°C 또는 37°C(표 1)에서 배양하고 설정된 시간 간격으로 인큐베이터에서 이미지화할 플레이트를 제거합니다.
2. 페트리 접시의 뚜껑을 접종된 배지를 담는 접시 위에 똑바로 세웁니다. 이미징 중 과도한 건조를 방지하기 위해 페트리 접시의 뚜껑에 물을 채우고 실험 내내 습도를 유지하기 위해 다른 투명 트레이를 사용하여 전체 설정을 동봉합니다.
3. 분자 이미징(MI) 소프트웨어를 사용하여 표 2에 설명된 이미징 설정을 사용하여 실온에서 분석을 실행합니다. 타임랩스 이미징의 경우 필요한 단계와 사양으로 프로토콜을 설정합니다.

표 1: 표면 운동성 분석 준비 사양. P. aeruginosa, B. subtilis 및 M. xanthus에 대한 표면 운동성 분석 준비 사양이 포함되어 있습니다.

	녹농균	P. aeruginosa: 덩굴손 형성 연구	B. 서브틸리스	M. 크산투스
하룻밤 국물 배양 배지	FAB 플러스 30 mM 포도당	FAB 플러스 30 mM 포도당	파운드	CTT(복합 매체)
하룻밤 국물 배양 배양 온도	37 °C	37 °C	37 °C	30°C에서 30시간
스웜 미디어	팹	FAB 마이너스(NH4)2SO4	2%(중량/부피) LB	CTT
스웜 미디어: 추가 구성 요소	12 mM 포도당a	10%(wt/vol) 카사미노산(CAA), 12mM 포도당a	해당 사항 없음	SYTO® 64a
한천 유형	한천, 고귀한	한천, 고귀한	과립 한천	한천, 고귀한 Affymetrix
한천 농도(wt/vol)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
군집 플레이트 크기	60 밀리미터	60 밀리미터	100 밀리미터	150 밀리미터
플레이트당 용지 부피	7.5 ml	7.5 ml	손으로 부은	손으로 부은
군집 배지 설정/건조 방법	두건; 덮이지 않은 판	두건; 덮이지 않은 판	벤치탑 플레이트 덮개	벤치탑 플레이트 덮개
스웜 미디어 설정/건조 시간	30 분	30 분	하룻밤(20 -24시간)	하룻밤(20 -24시간)
군집 분석 배양 온도	30 또는 37 °C	30 °C	37 °C	30 °C
타임랩스 이미징을 위한 인큐베이션	30°C에서 최소 4시간 동안	30°C에서 최소 4시간 동안	37°C에서 2시간 동안	12시간 동안 RT
타임랩스 캡처 길이	24 시간	24 시간	10 시간	66시간
타임랩스 설정	1 프레임/10 분	1 프레임/10 분	1 프레임/6 분	1 프레임/10 분
a 고압멸균 후 추가됨.

 

표 2: 이미징 사양. 박테리아 표면 성장의 적색 및 녹색 형광 및 발광 이미징을 위한 Bruker 이미징 스테이션 사양.

신호	녹색 형광	적색 형광 I	적색 형광 II	발광
단백질 또는 염료	녹색 형광 단백질(GFP)	mCherry 단백질 또는 나일 레드 람놀지질 염색	시토® 64	럭스 오페론의 루시페라제
여기 파장(nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	꺼짐
방출 파장(nm)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	필터 없음
노출 시간(초)	30	60	60	240
F-스톱	4.0	4.0	2.5	1.1
FOV(mm)	190	190	140	120
초점면(mm)	27.5	27.5	12.2	4
비닝(픽셀)	없음	2 x 2	없음	8 x 8

재료