Streptomyces의 발달 돌연변이를 평가하기 위한 위상차 현미경

초록

출처: Bennett, JA et al. Streptomyces 발달 돌연변이체의 시각적 및 현미경적 평가. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 위상차 현미경을 사용하여 야생형과 돌연변이 Streptomyces coelicolor 사이의 표현형 차이를 조사하는 방법을 보여줍니다. 포자 형성의 발달 결함을 감지하기 위해 공중 필라멘트를 준비하고 이미징하는 것과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. 위상차 현미경 수행

1. 핀셋은 70% 에탄올로 세척한 다음 분젠 버너 불꽃을 통과시켜 에탄올을 증발시켜 멸균합니다. 식히십시오.
2. 커버슬립을 70% 에탄올로 세척한 다음 멸균 페트리 접시에서 건조시켜 멸균합니다.
3. 검사할 박테리아 성장의 커버슬립 리프트를 준비합니다.
   1. 멸균 핀셋으로 멸균 커버슬립을 집어 들고 Streptomyces coelicolor 박테리아 성장이 조밀한 만니톨 콩가루(MS) 한천 플레이트에 커버슬립을 놓습니다. 핀셋으로 커버슬립 뒷면을 부드럽게 눌러 박테리아 포자와 공중 균사체가 충분히 전달되도록 합니다.
4. 플레이트에서 커버슬립을 집어 들고 세포 물질이 있는 면이 현미경 슬라이드 표면을 향하도록 배치하고 장착을 위해 물에 50% 글리세롤 15μL 방울을 떨어뜨립니다. 커버슬립을 슬라이드에 대해 45° 각도로 놓고 50% 글리세롤 위에 떨어뜨려 기포를 줄입니다.
5. (선택 사항) 슬라이드 보존을 위해 투명 매니큐어로 밀봉하십시오.
6. 수명 주기 동안 다양한 시간 간격으로 위상차 현미경을 수행합니다.
   메모: 반복 이미징을 통해 보다 완벽한 분석과 개발 지연을 감지할 수 있습니다. 정확성과 재현성을 보장하기 위해 관찰을 독립적으로 반복합니다.
   1. 준비된 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 커버슬립 중앙에 침지 오일 한 방울을 추가합니다. 100X 위상 대물렌즈를 제자리에 회전시키고 콘덴서 터렛을 적절한 "일치" 위상 설정으로 설정합니다. 대물 렌즈가 오일에 닿으면 미세 조정 손잡이만 사용하여 이미지의 초점을 맞춥니다.
   2. 포자 형성 능력, 포자 크기 및 모양, 전체 포자 수와 같은 돌연변이 균주와 야생형 사이의 눈에 띄고 일관된 차이를 식별하기 위해 여러 시야를 조사합니다( 그림 1 참조).
      메모: 위상차 현미경의 대안으로는 미차 간섭 대비(DIC) 현미경과 크리스탈 바이올렛 염색과 같은 명시야 현미경과 함께 사용하기 위한 간단한 염색 기술이 있습니다.

결과

그림 1: 무작위 트랜스포존 삽입 돌연변이를 포함하는 Streptomyces coelicolor 백색 돌연변이 균주에 대한 대표적인 공중 필라멘트를 보여주는 위상차 현미경 사진. (A) 도시된 것은 동시적이고 규칙적인 간격의 세포 분열을 거쳐 균일한 모양과 크기의 포자를 생성하는 대표적인 야생형 공중 필라멘트입니다(MT1110). ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
글리세롤 50%	시그마-알드리치	지5516
침지 오일(DF형)	크라질	16482
멸균수	진메이트	G-3250-1L
100% 에탄올	시그마-알드리치	E7023
콩가루	밥스 레드 밀	1516C164
D-만니톨	시그마-알드리치	M4125-1KG
한천	시그마-알드리치	A1296-1KG
글리세롤 100%	VWR amresco 생명 과학	0854-1L
페트리 접시	시그마-알드리치	P5856-500EA
표지 전표 #1.5	토마스 사이언티픽	64-0721
슬라이드	캐롤라이나	63-2010
위상차 현미경	올림푸스	BX40 시리즈
집게	캐롤라이나 생물학	624504
분젠 버너	캐롤라이나 생물학	706706
투명 매니큐어	OPI	22001009000
현미경용 카메라	올림푸스	DP72 시리즈
니트릴 검사 장갑(Med)	바이오 엑셀	71011002