숙주 박테리아를 사용한 Saccharibacteria의 이원 배양 확립

초록

출처: Collins, AJ, et al., 구강에서 공생 사카리박테리아의 안정적인 이진 배양 확립. J. Vis. Exp. (2021년)

이 비디오는 Saccharibacteria와 숙주 박테리아를 숙주 특이적 성장 배지에서 순차적으로 공동 배양하여 이진 배양의 확립 및 유지를 보여줍니다.

프로토콜

1. 원심분리에 의한 사카리박테리아 세포 농축
   1. 튜브와 캡에 방향 표시를 하고 상단에 표시가 있는 튜브를 고속 원심분리기에 넣습니다. 원심분리로 형성된 펠릿은 일반적으로 보이지 않습니다. 표시는 원심분리가 완료되고 튜브가 원심분리기에서 제거될 때 Saccharibacteria 세포의 펠릿이 어디에 있는지 결정하는 데 도움이 됩니다.
   2. 샘플을 60,000 x g 에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리합니다.
      메모: 이 힘과 시간은 모든 Saccharibacteria 세포를 펠릿화하기에 충분합니다. 그러나 사카리박테리아 세포는 20,000 x g에서 최소 20분 동안 원심분리하여 적어도 부분적으로 펠릿화될 수 있습니다.
   3. 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 튜브에서 액체를 붓고 펠릿을 튜브 윗면에 유지합니다.
   4. 일반적으로 보이지 않는 펠릿을 1-2mL의 MRD(최대 회수율 희석제) 완충액에 격렬한 와류에 재현탁합니다.

2. 당박테리아가 풍부한 여과액으로 숙주 배양균을 감염시킵니다.

1. 2mL의 적절한 성장 배지(예: TSBY(0.1% 효모 추출물이 함유된 트립틱 콩 국물), BHI(Brain Heart Infusion) 등)를 튜브에 분취하여 배양 튜브를 준비합니다.
2. 숙주 유기체의 하룻밤 배양액 200μL를 각 튜브에 추가합니다. 100-200μL의 재현탁되고 여과된 샘플을 각 튜브에 추가합니다.
3. 숙주 유기체에 적합한 결합 샘플을 배양합니다(예: Arachnia propionica의 경우 호기성 분위기에서 37°C).
4. 200μL의 이원 배양을 새 튜브의 신선한 성장 배지 2mL로 옮겨 2-3일마다 세포를 계대시킵니다. 계대된 배양물이 성장을 보이지 않는 것으로 보이면(즉, 신선한 배지로 통과된 후 배양의 탁도/광학 밀도가 증가하지 않음) Saccharibacteria는 모든 숙주 유기체를 압도하거나 죽일 수 있습니다. 이를 해결하려면 세포를 계대할 때 감염되지 않은 숙주 배양 200μL를 추가합니다. 최소 5개 구절 동안 반복합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Brain Heart Infusion Broth (탈수 분말)	벡턴-디킨슨	211059	또는 표적 유기체에 적합한 기타 성장 배지
원심분리기 로터 70-Ti	베크만 쿨터	337922
2 InVitro 글러브 박스 제어	수줍은 라오라토리	31615	미호기성 유기체에 필요한 경우
Optima L-100 XP 고속 원심분리기	베크만 쿨터	8043-30-1124
P-1000 마이크로 피펫	길슨	F123601G
P-200 마이크로 피펫	길슨	F123602G
PBS(인산염 완충 식염수)	피셔 사이언티픽	BP399500
펩톤	피셔 사이언티픽	BP1420-500
피펫 팁 - 1000 μL	피셔 사이언티픽	02-717-166
피펫 팁 - 200 μL	피셔 사이언티픽	02-717-165
스크류 캡 원추형 원심분리기 튜브 15 mL	송골매	352096	또는 박테리아 배양에 적합한 다른 튜브
두꺼운 벽 폴리카보네이트 25 x 89 mm (26.3mL 용량) 원심분리기 튜브(캡 포함)	베크만 쿨터	355618
트립스 대두 혈액 한천 플레이트	북동부 실험실 서비스	피1100	또는 숙주 유기체의 성장에 충분한 다른 한천 플레이트
트립산 콩 국물(탈수 분말)	벡턴-디킨슨	211825	또는 표적 유기체에 적합한 기타 성장 배지
효모 추출물	피셔 사이언티픽	BP1422-500