한천 배양에서 아황산염 환원 혐기성 박테리아를 계대 배양

초록

출처: Anwar, Z., et al. 소매 식품 샘플에서 Clostridium perfringens 독소형의 농축 및 검출. J. Vis. 경험. (2019).

이 비디오에서는 아황산염 환원균을 아황산염 함유 한천 배지에서 배양하여 혐기성 성장하여 아황산염을 황화수소로 환원하여 철 이온과 함께 검은색 침전물을 형성합니다. 검은 콜로니는 무균 기술을 사용하여 한천 깊이에서 분리되고 지속적인 혐기성 배양을 위해 신선한 배지로 옮겨집니다.

프로토콜

참고: 클로스트리디움 퍼프린겐 스는 생물안전 위험 수준 2(BSL2) 유기체로 간주됩니다. 모든 식품 샘플에 C. 퍼프린겐스가 포함되어 있는 것은 아니지만 배양된 모든 샘플은 그렇게 취급되어야 합니다. 모든 적절한 예방 조치와 개인 보호 장비(PPE)를 항상 착용해야 합니다. 폐기 전에 모든 물질의 오염을 제거하십시오.

1. 변형된 RPM(Rapid perfringens medium)을 준비합니다.

1. 30g/L 유체 티오글리콜레이트 배지, 60g/L 젤라틴, 5g/L 펩톤, 5g/L 포도당, 5g/L 인산이염기성 칼륨, 3g/L 효모 추출물, 1.5g/L 염화나트륨, 0.5g/L 황산제일철을 탈이온수에 고르게 분산될 때까지 섞습니다. 우리는 일반적으로 1L 배치를 만듭니다.
2. 121°C에서 15분 동안 오토클레이브합니다.
3. 약 40°C까지 식히십시오.
4. RPM이 식으면 D-사이클로세린을 최종 농도 440mg/L까지 첨가합니다.
   메모: 멸균수에 50mg/mL로 용해된 D-사이클로세린의 스톡 농도는 향후 사용을 위해 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
5. 10mL의 RPM을 15mL 원뿔형 튜브로 무균 이송합니다. RPM은 일괄적으로 준비하여 최대 1개월 동안 4....

결과

그림 1: TSC 한천 샌드위치 기술의 개략도.

C. 퍼프린겐스 박테리아를 포함하는 RPM 배지는 혐기성 환경을 촉진하기 위해 TSC 한천의 두 층 사이에 도금됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
D-사이클로세린	시그마-알드리치	C6880
포도당	시그마 생명 과학	D9434-250G
일회용 이송 피펫	모든 브랜드		Thermo Scientific 일회용 이송 피펫 137116M/EMD와 같이 팁이 슬림한 제품을 선택하십시오.
DNeasy 혈액 및 조직 키트	키아겐	69504	참고: 수많은 DNA 및 플라스미드 추출 키트가 평가되었으며 이 키트는 가장 바람직한 결과를 제공했습니다.
건식 인큐베이터	모든 브랜드
유체 티오글리콜레이트 배지	레멜	R453452
돼지 껍질에서 추출한 젤라틴	시그마 생명 과학	G1890-500G
황산철(II) 칠수화물	시그마 생명 과학	F8633-250 그램
닭고기 달걀 흰자에서 추출한 리소자임	시그마-알드리치	L6876	DNA 추출에 필요하며 키트에 제공되지 않음
파라필름 또는 플라스틱 랩	모든 브랜드
카제인 및 기타 동물성 단백질에서 추출한 펩톤	시그마-알드리치	70173-100G
퍼프린겐스 한천 베이스(TSC + SFP)	옥소이드	CM0587	지침에 따라 TSC 한천을 만드십시오.
인산이염기성 칼륨	시그마-알드리치	P2222-100G
소금	시그마-알드리치	S-7653
멸균 세포 스크레이퍼	모든 브랜드
멸균 세포 스프레더	모든 브랜드
멸균 페트리 접시	모든 브랜드
효모 추출물	시그마-알드리치	70161-100G