스트레스 유도 박테리아에서 분리된 (p)ppGpp 뉴클레오티드의 박층 크로마토그래피 기반 분리

Abstract

출처: Fernández-Coll, L. 및 Cashel, M. 대 장균 (p)ppGpp의 다중 생체 내 측정에 이어 박층 크로마토그래피를 위해 마이크로타이터 접시 방사성 표지를 사용합니다. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 박층 크로마토그래피(TLC)를 사용하여 박테리아 스트레스 반응 뉴클레오티드 ppGpp 및 pppGpp의 수준과 역학을 측정하기 위한 고처리량 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 다양한 스트레스 조건에서 박테리아 배양에서 (p)ppGpp를 정량화하는 강력하고 신속하며 비용 효율적인 접근 방식을 제공하여 박테리아 생리학 및 엄격한 반응에 대한 고해상도 분석을 가능하게 합니다.

Protocol

1. 박층 크로마토그래피
   1. 부드러운 연필로 가위로 상단에서 5cm를 제거한 20cm x 20cm 폴리에틸레니민-셀룰로오스(PEI-셀룰로오스) 박층 크로마토그래피(TLC) 플레이트의 가장자리에서 1cm의 원점을 표시합니다. 각 샘플에 대해 PEI 표면에 5μL를 액적으로 도포합니다. 이 부분을 건조시키지 않고 오름차순 개발을 시작하면 줄무늬를 최소화하여 해상도가 향상됩니다.
   2. 액체가 원점 샘플 지점에 닿지 않도록 충분히 얕은 1.5M KH₂PO₄ (pH 3.4) 용액 층이 있는 탱크에서 오름차순 현상을 수행합니다. 탱크를 밀폐 밀봉으로 덮고 액체가 트리밍된 시트의 상단까지 15cm 상승하도록 합니다. 1.5M KH₂PO₄ 용액에 대해 pH 3.4를 달성하려면 H₃PO₄를 첨가하여 pH를 조정해야 합니다.
   3. 완전히 현상된 크로마토그램을 제거하고 실온에서 자연 건조합니다.
   4. 유리 ³²P를 포함하는 크로마토그램의 상단(pH 전면) 부분을 잘라서 방사성 폐기물로 폐기합니다. 이 부분은 그림 1 에서 노란색으로 표시되며 UV 광선 아래에서 쉽게 시각화할 수 있습니다. 구아노신 삼인산(GTP)보다 느리게 이동하는 (p)ppGpp 뉴클레오티드만 측정하는 경우 UV 가시광선 GTP 표준물질을 실행한 다음 더 큰 상부( 그림 1과 같이 GTP 이상의 모든 부분)를 잘라서 폐기하는 것이 좋습니다.
   5. 형광체 스크린으로 밤새 자방사선 촬영 필름을 노출시킵니다.
   6. 필름을 현상합니다. 인광체 스크린 신호를 포착하고 인광이미저로 정량화합니다.
       
2. (p)ppGpp의 정량
   1. 이미지 J로 방사성 반점을 정량화합니다.
      메모: (p)ppGpp의 양은 각 샘플에서 관찰된 G 뉴클레오티드의 총량으로 정규화될 수 있습니다(그림 1). 배경의 양이 균질한 경우 단일 공백( 그림 1의 상자 4)을 빼서 배경을 수정할 수 있습니다. 총 G는 감지된 GTP + ppGpp + pppGpp의 합입니다. 이 정규화는 구아노신 일인산(GMP) 및 구아노신 이인산(GDP) 수준이 무시할 수 있다고 가정하며, 이는 대장균에 해당됩니다. 총 G에 대한 주어진 뉴클레오티드의 비율은 적용된 샘플 부피의 변화를 보정하는 중요한 방법을 제공합니다.

Results

그림 1: 대표적인 TLC 분석. TLC로 밤새 자동 방사선 촬영 및 형광체 스크리닝 후 얻은 결과의 개략도. 측정할 지점은 빨간색으로 표시됩니다. ppGpp의 분수를 계산하는 공식도 표시됩니다. 총 G는 샘플에서 검출된 GTP + ppGpp + pppGpp의 총량을 나타냅니다. 노란색 띠는 자외선 아래에서 볼 수 있는 pH 전선을 나타냅니다. 가위는 대부분의 방사능을 버리기 위해 크로마토그램을 절단하는 것이 권...

Materials