스트레스 유도 박테리아에서 분리된 (p)ppGpp 뉴클레오티드의 박층 크로마토그래피 기반 분리

Abstract

출처: Fernández-Coll, L. 및 Cashel, M. 대 장균 (p)ppGpp의 다중 생체 내 측정에 이어 박층 크로마토그래피를 위해 마이크로타이터 접시 방사성 표지를 사용합니다. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 박층 크로마토그래피(TLC)를 사용하여 박테리아 스트레스 반응 뉴클레오티드 ppGpp 및 pppGpp의 수준과 역학을 측정하기 위한 고처리량 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 다양한 스트레스 조건에서 박테리아 배양에서 (p)ppGpp를 정량화하는 강력하고 신속하며 비용 효율적인 접근 방식을 제공하여 박테리아 생리학 및 엄격한 반응에 대한 고해상도 분석을 가능하게 합니다.

Protocol

1. 박층 크로마토그래피
   1. 부드러운 연필로 가위로 상단에서 5cm를 제거한 20cm x 20cm 폴리에틸레니민-셀룰로오스(PEI-셀룰로오스) 박층 크로마토그래피(TLC) 플레이트의 가장자리에서 1cm의 원점을 표시합니다. 각 샘플에 대해 PEI 표면에 5μL를 액적으로 도포합니다. 이 부분을 건조시키지 않고 오름차순 개발을 시작하면 줄무늬를 최소화하여 해상도가 향상됩니다.
   2. 액체가 원점 샘플 지점에 닿지 않도록 충분히 얕은 1.5M KH₂PO₄ (pH 3.4) 용액 층이 있는 탱크에서 오름차순 현상을 수행합니다. 탱크를 밀폐 밀봉으로 덮고 액체가 트리밍된 시트의 상단까지 15cm 상승하도록 합니다. 1.5M KH₂PO₄ 용액에 대해 pH 3.4를 달성하려면 H₃PO₄를 첨가하여 pH를 조정해야 합니다.
   3. 완전히 현상된 크로마토그램을 제거하고 실온에서 자연 건조합니다.
   4. 유리 ³²P를 포함하는 크로마토그램의 상단(pH 전면) 부분을 잘라서 방사성 폐기물로 폐기합니다. 이 부분은 그림 1 에서 노란색으로 표시되며 UV 광선 아래....

Results

그림 1: 대표적인 TLC 분석. TLC로 밤새 자동 방사선 촬영 및 형광체 스크리닝 후 얻은 결과의 개략도. 측정할 지점은 빨간색으로 표시됩니다. ppGpp의 분수를 계산하는 공식도 표시됩니다. 총 G는 샘플에서 검출된 GTP + ppGpp + pppGpp의 총량을 나타냅니다. 노란색 띠는 자외선 아래에서 볼 수 있는 pH 전선을 나타냅니다. 가위는 대부분의 방사능을 버리기 위해 크로마토그램을 절단하는 것이 권.......

Materials