거대 소포 내 박테리아의 단일 세포 배양

초록

출처: Morita, M., et al. 거대 소포 내부의 단일 세포 수준에서 박테리아 세포 배양. J. Vis. 경험. (2019).

이 비디오는 지지된 지질 이중층에 고정된 거대한 소포 내부에 캡슐화된 개별 박테리아 세포를 배양하고 관찰하는 방법을 보여줍니다. 이 시스템은 제한된 생리학적으로 관련된 미세 환경에서 단일 세포 성장 역학의 안정적이고 장기적인 이미징을 가능하게 합니다.

프로토콜

1. 거대 소포(GV) 관찰 시스템(Bacterial Cell Culture System) 준비

1. 지지된 이중층 멤브레인을 구성하기 위한 작은 소포(SV)의 준비
   1. POPC(1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린) 용액 20μL와 비오틴-PEG-DSPE(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에틸렌글리콜)-2000) 용액 4μL를 유리관에 붓습니다.
   2. 기류에 의해 유기 용매를 증발시켜 지질 막을 형성하고 이 샘플을 데시케이터에 1시간 동안 넣어 유기 용매를 완전히 증발시킵니다.
   3. 1x LB(Luria-Bertani 국물) 배지(GV의 외부 수용액)에 200μL의 200mM 포도당을 유리 바이알에 첨가합니다.
   4. 유리 바이알의 입구 부분을 필름으로 감싸고 초음파 수조 (120W)에서 최소 1 시간 동안 초음파 처리합니다.
   5. 미니 압출기와 기공 크기가 100nm인 폴리카보네이트 멤브레인을 사용하여 압출 방법으로 SV를 제조합니다.
2. 수제 챔버 준비
   1. 양면 씰(10mm x 10mm x 1mm)에 중공 펀치로 7mm 구멍을 뚫습니다.
   2. 구멍이 있는 양면 씰을 커버 유리(30mm x 40mm, 두께 0.25–0.35mm)에 붙입니다.
3. 챔버 구멍의 커버 유리에 지지되는 이중층 멤브레인의 준비
   1. 챔버의 구멍(섹션 2.2에서 준비됨)에 30μL의 SV 용액을 추가하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
   2. 피펫팅을 통해 200mM 포도당(GV의 외부 수용액)을 함유한 1x LB 배지 20μL로 구멍을 부드럽게 두 번 세척합니다.
4. 챔버 구멍의 커버 유리에 있는 지지된 이중층 멤브레인에 GV를 고정합니다.
   1. GV의 외부 수용액(1mg/mL)과 함께 10μL의 뉴트라비딘을 구멍에 넣고 RT에서 15분 동안 배양합니다.
   2. 피펫팅을 통해 200mM 포도당(GV의 외부 수용액)을 함유한 1x LB 배지 20μL로 구멍을 부드럽게 두 번 세척합니다.
   3. GV를 포함하는 모든 용액을 챔버 구멍에 넣고 커버 유리(18mm x 18mm, 두께 0.13–0.17mm)로 밀봉합니다(그림 1b).
5. GV 내부의 박테리아 세포 성장의 현미경 관찰
   1. 긴 작동 거리를 가진 40x/0.6 개구수(NA) 대물 렌즈가 장착된 도립 현미경으로 현미경 가열 스테이지 시스템을 설정합니다(그림 1b).
   2. 챔버를 현미경 가열 스테이지 시스템에 놓습니다(그림 1b). 37°C에서 6시간 동안 정적 조건에서 챔버에 박테리아 세포를 포함하는 GV를 배양합니다.
   3. 과학적 상보형 금속 산화물 반도체(sCMOS) 카메라를 사용하여 30분마다 GV 내부의 박테리아 세포 성장에 대한 현미경 이미지를 캡처하고 기록합니다.

결과

그림 1: GV 내부의 박테리아 세포 배양 관찰 시스템. (a) GV는 커버 유리의 비오틴-뉴트라비딘 결합을 통해 지지된 멤브레인에 고정됩니다. GV는 가열 시스템에 의해 배양됩니다. (b) 수제 챔버를 포함한 관찰 시스템의 사진.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
박토트립톤	BD 바이오사이언스	211705
클로로포름	와코 퓨어 케미칼	032-21921
커버 유리(18 × 18 mm)	마쓰나미 유리 공업	C018181	두께 0.13–0.17 mm
커버 유리(30 × 40mm)	마쓰나미 유리 공업	맞춤 주문	두께 0.25–0.35 mm
데스크탑 원심분리기	하이테크 주식회사	ATT101	스윙 로터 유형
양면 씰(10 × 10 × 1 mm)	니톰스	티4613
포도당	와코 퓨어 케미칼	049-31165
도립 현미경	올림푸스	IX-73 시리즈
메탄올	와코 퓨어 케미칼	133-16771
미세한 가열 스테이지 시스템	도카이 히트	TP-110R-100 시리즈
미네랄 오일	나칼라이 테스크	23334-85
뉴트라비딘	써모 피셔 사이언티픽	31000
대물 렌즈	올림푸스	LUCPLFLN 40×/0.6 NA
폴리카보네이트 멤브레인	Avanti 극성 지질	610005
sCMOS 카메라	안도르	질라 4.2 플러스	기공 크기 100nm
소금	와코 퓨어 케미칼	191-01665
자당	와코 퓨어 케미칼	196-00015
초음파 수조	하나로	ASU-3D
효모 추출물	BD 바이오사이언스	212750
뚜껑이 있는 플라스틱 튜브 0.6mL	왓슨	130-806C
뚜껑이 있는 플라스틱 튜브 1.5mL	스미토모 베이클라이트 주식회사	MS4265-M
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린	Avanti 극성 지질	850457P
1,2-디스테아로일-스엔글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에틸렌글리콜)-2000]	Avanti 극성 지질	880129P	팝
			비오틴-PEG-DSPE