에틸렌 방출 화합물을 이용한 에틸렌에 대한 박테리아 반응 조사

초록

출처: Augimeri, RV et. al., 박테리아의 에틸렌 반응을 연구하기 위한 도구로 에틸렌 방출 화합물인 2-클로로에틸포스폰산을 활용합니다. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 2-클로로에틸포스폰산(CEPA)에 의해 생성된 에틸렌이 박테리아 성장 및 셀룰로오스 생산에 미치는 영향을 보여줍니다. 에틸렌은 셀룰로오스 합성을 자극하는 신호 전달 경로를 활성화하여 펠리클 형성을 향상시킵니다. 이러한 결과는 에틸렌에 대한 박테리아 반응을 강조합니다.

프로토콜

1. 펠리클 분석
   1. Komagataeibacter xylinus 스타터 배양액을 3부로 성장시키고 정량화합니다.
      1. 3부로, Komagataeibacter xylinus 의 단일 콜로니를 0.2%(v/v) 필터 멸균 셀룰라아제가 보충된 Schramm 및 Hestrin(SH) 배지(pH 5) 5ml에 접종합니다. 600nm(OD₆₀₀)에서 0.3 내지 0.4의 광학 밀도에 도달할 때까지(약 72시간) 150rpm에서 교반하면서 30°C에서 배양합니다.
      2. 원심분리(2,000 x g, 4°C, 10분)를 통해 스타터 배양액을 수확합니다. 멸균 식염수 5ml로 세포를 두 번 세척하고 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
      3. Petroff-Hausser 계수 챔버를 사용하여 세포를 정량화합니다.
   2. 24웰 플레이트에 접종하기 위한 마스터 믹스 준비:
      1. 60ml의 SH 배지(pH 7)에 120μl의 5, 50 및 500 mM 2-클로로에틸포스폰산(CEPA) 스톡을 보충하여 각각 0.01, 0.1 및 1.0 mM의 최종 CEPA 농도를 얻습니다. CEPA를 용해시키는 데 사용되는 용매 120μl로 SH 배지(pH 7) 60ml를 추가로 보충합니다. 혼합할 소용돌이.
      2. CEPA 함유 배지 60ml를 14ml 분취량 4개로 나눕니다. 14ml 분취량 중 3개를 10⁵ cells/ml의 농도로 스타터 배양의 생물학적 복제물로 접종합니다. 셀룰로오스 생성을 방지하기 위해 세포가 있는 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
         메모: 나머지 14ml 분취량은 멸균 대조 우물에 사용됩니다.
   3. 24웰 플레이트 접종:
      1. 3줄의 생물학적 복제물과 한 줄의 멸균 대조군을 사용하여 자체 플레이트에서 각 처리를 테스트합니다(그림 1).
      2. 14ml 마스터 믹스를 사용하여 멸균 24웰 플레이트의 6웰 각각에 2ml를 추가합니다. 3개의 생물학적 복제 및 멸균 대조군에 대해 완료되었습니다(그림 1). 각 치료에 대해 반복합니다.
      3. 판을 파라핀 필름으로 밀봉하고 30°C에서 7일 동안 정적으로 배양합니다.
      4. 펠리클 건조 중량(셀룰로오스 수율) 수확 및 측정(그림 1):
         1. 펠리클을 6웰 플레이트의 웰에 개별적으로 옮깁니다. 세포를 용해하려면 펠리클을 12ml의 0.1N 수산화나트륨(NaOH)으로 80°C에서 20분 동안 처리합니다.
         2. NaOH를 제거하고 초순수로 24시간 동안 교반하면서 세척하여 펠리클을 중화시킵니다. 6시간마다 물을 갈아주세요.
            메모: 펠리클은 세척 단계가 완료되면 흰색이어야 합니다.
         3. 펠리클 추를 실리콘 매트 위에 놓고 50°C에서 48시간 동안 일정한 무게로 건조시킵니다. 건조되면 매트에서 제거하고 분석 저울로 무게를 측정하여 박테리아 셀룰로오스 수율을 결정합니다.

결과

그림 1: 펠리클 분석 및 분석에 사용되는 프로토콜을 보여주는 순서도. 스톡 CEPA 보충 pH 7 SH 배지(60ml)를 3개의 개별 생물학적 복제 접종 및 멸균 대조군(각각 14ml)을 위해 분취됩니다. 그런 다음 이러한 배양액을 24웰 플레이트에 6개의 기술 복제본(2ml)로 분취한 다음 파라핀 필름으로 밀봉합니다. 30°C에서 7일 동안 배양한 후 펠리클을 수확하고 FT-IR에 의해 습윤량, 두께, 건조량, 결정화도를 측정하여 특성화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Trichoderma reesei ATCC 26921의 셀룰라아제	시그마	C2730	수용액
구연산	바이오샵	CIT002.500	SH 매체용
에테폰(≥ 96%, 2-클로로에틸포스폰산)	시그마	C0143	에틸렌 방출 화합물
포도당	바이오베이직	GB0219	SH 매체용
코마가타에이박터 자일리누스 ATCC 53582	ATCC	53582	세균성 셀룰로오스 생성 알파 프로테오박테리움
인산나트륨, 이염기성 칠수화물	바이오샵	스피드 579.500	인산나트륨, SH 배지용 이염기성 칠수화물
나크롬	바이오베이직	SOD001.1 시리즈	식염수 및 대조 용액용 염화나트륨
인산나트륨, 일염기성 일수화물	바이오샵	SPM306.500	인산나트륨, 대조군용 일염기성 일수화물
나오	바이오샵	쉬700.500	pH 조절을 위한 수산화나트륨
파라핀 필름	파라필름	PM996	플레이트 및 플라스크 밀봉용
펩톤(세균학적)	바이오샵	PEP403.1	SH 매체용
Petroff-Hausser 계수 챔버	Hausser scientific	3900	박테리아 세포 계수 챔버
폴리에테르설폰 멸균 필터 0.2μm	VWR	28145-501	셀룰라아제 살균용
효모 추출물	바이오베이직	지0961	SH 매체용