박테리아 숙주에서 자살 플라스미드의 증폭

초록

출처: Tomás, JM, et al. 박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 null 돌연변이체의 생성. J. Vis. 경험. (2022).

이 비디오는 대장균 에서 자살 플라스미드의 개시자 의존적 증폭을 보여줍니다.항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드는 숙주에 의해 암호화된 개시제 단백질이 있는 경우에만 복제됩니다. 전기천공 및 회수 배지에서 배양한 후, 혼합물을 항생제 함유 한천에 도금합니다. 플라스미드를 가진 박테리아는 개시제 단백질이 플라스미드의 항생제 내성 유전자를 발현할 수 있기 때문에 생존합니다.

프로토콜

1. 편모 글리코실화 섬 유전자에서 null 돌연변이체의 생성

참고: 이 돌연변이 유발 방법은 자살 벡터 pDM428(GenBank: KC795686.1)을 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR) 프레임 내 결실 산물의 대립유전자 교환을 기반으로 합니다. pDM4 벡터의 복제는 람다 피르 에 의존적이며, 벡터에 위치한 sacB 유전자를 활용하여 완전한 대립유전자 교환을 강제합니다.

1. PCR 인프레임 결실 산물의 구성.
   1. 삭제할 선택된 유전자 또는 영역의 DNA 영역 업스트림(A 및 B 프라이머) 및 다운스트림(C 및 D 프라이머)을 증폭하는 두 쌍의 프라이머를 설계합니다(그림 1B).
   2. 프라이머 A와 D가 삭제할 유전자의 시작에서 각각 600bp 이상의 업스트림과 중지에서 다운스트림에서 600bp 이상을 가지고 있는지 확인합니다. 이 두 프라이머는 pDM4에서 클로닝을 허용하는 엔도뉴클레아제에 대한 5' 말단에 제한 부위를 포함해야 합니다.
      참고: A 및 D 프라이머의 5' 말단에 포함된 제한 부위는 AB 또는 CD 앰플리콘 내의 부위와 동일해서는 안 됩니다.
   3. 프라이머 B와 C가 삭제할 유전자 내에 있거나 각각 삭제할 영역의 첫 번째 및 마지막 유전자 내부에 있는지 확인합니다. 두 프라이머(B 및 C)가 모두 프레임 내에 있고 유전자 내부의 5-6개 코돈 사이에 위치하는지 확인합니다. 또한, 두 프라이머 모두 5' 말단에 DNA 앰플리콘 AB 및 CD를 결합할 수 있는 21bp 상보적 서열(표 1)을 포함하는지 확인하십시오.
   4. 선택한 Aeromonas 균주를 트립산 대두 국물 5mL에서 30°C에서 밤새(O/N)로 배양합니다. 게놈 DNA 정제를 위해 시중에서 판매되는 키트를 사용하고 제조업체의 지침( 재료 표)을 따르십시오. 분광 광도계를 사용하여 정제된 DNA 2μL를 정량화합니다.
      참고: 260nm에서 흡광도를 기록하도록 기기를 설정한 상태에서 이중 증류수를 블랭크로 사용합니다. 2μL의 정제된 DNA로 흡광도를 3-5회 기록하고 평균 흡광도 판독값을 계산합니다. Beer-Lambert 법칙을 사용하여 DNA 농도를 계산합니다.여기서 A = Ɛ.c.l. 여기서 "A"는 흡광도, "Ɛ"는 DNA의 몰 평균 소광 계수, "c"는 DNA 농도, "l"은 경로 길이입니다(각 기기의 경로 길이는 제조업체의 지침 참조).
   5. A-B 및 C-D 프라이머가 있는 두 세트의 비대칭 PCR에서 정제된 염색체 DNA 100ng를 주형으로 사용합니다( 재료 표). A:B 및 D:C 프라이머 쌍의 10:1 몰비를 사용합니다.
      참고: 비대칭 PCR은 템플릿의 한 가닥을 다른 가닥보다 우선적으로 증폭할 수 있습니다.
   6. 1% 아가로스 겔에서 전기영동으로 PCR 산물을 분석합니다. TAE(40mM Tris-acetate, 1mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA))를 겔 실행 완충액으로 사용하고 8V/cm의 전력 설정을 사용합니다. DNA를 시각화하려면 겔에 에티듐 브로마이드(0.5μg/mL)를 첨가하고 바이오 이미징 스테이션(재료 표)을 사용하여 PCR 산물을 시각화합니다.
   7. 메스를 사용하여 겔에서 앰플리콘을 절제하고 제조업체의 프로토콜(재료 표)에 따라 정제하고 정량화합니다.
   8. PCR 산물의 3' 말단에서 21bp 중첩 서열에 의해 AB 및 CD 앰플리콘을 결합합니다(그림 2). PCR 튜브에 각 앰플리콘(AB 및 CD) 100ng를 PCR 시약(pre-AD PCR)과 혼합하되 프라이머 없이 혼합하고 열순환기 프로그램을 사용하여 확장합니다. 그런 다음 반응에 100μM의 A 및 D 프라이머를 첨가하고(AD PCR) 단일 단편으로 증폭합니다.
   9. 1.1.6단계에 설명된 조건을 사용하여 1% 아가로스 겔에서 전기영동으로 PCR 산물(AD 앰플리콘)을 분석하고, 겔에서 앰플리콘을 절제하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 정제하고, 앰플리콘을 정량화합니다(재료 표).
2. 프레임 내 결실을 통한 pDM4 재조합 플라스미드의 구성.
   1. 30°C에서 클로람페니콜(25μg/mL)과 함께 Luria-Bertani(LB) Miller 국물(10mL)에서 pDM4를 함유한 대 장 균 cc18λ pir 의 O/N 배양액을 성장시킵니다.
   2. 배양액을 4°C에서 5,000 x g으로 회전시키고 펠릿을 600μL의 멸균 증류수에 현탁합니다. 제공자의 지침에 따라 시중에서 판매되는 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드 pDM4의 추출 및 정제를 수행합니다( 재료 표).
   3. AD 앰플리콘의 양쪽 끝과 pDM4의 클로닝 부위를 소화할 수 있는 엔도뉴클레아제를 사용하여 pDM4 1μg과 AD 앰플리콘 400ng을 2시간 동안 분해합니다(그림 2). 반응 조건에 대한 효소 제조업체의 프로토콜을 따르십시오( 재료 표).
   4. DNA 정제 키트를 사용하여 소화된 플라스미드와 앰플리콘을 세척하고 제조업체의 지침( 재료 표)에 따라 정량화합니다.
   5. 선형화된 pDM4의 열정을 방지하려면 제조업체의 지침에 따라 알칼리성 포스파타제 효소를 사용하여 양쪽 5' 말단에서 인산염기를 제거하십시오( 재료 표). 그런 다음 처리된 플라스미드를 정제하고 1.1.4단계(재료 표)에 설명된 대로 분광 광도계를 사용하여 정량화합니다.
   6. 150ng의 소화 및 포스파타제 알칼리성 처리된 pDM4와 95-100ng의 소화된 AD 앰플리콘을 1:4의 몰 벡터:삽입 비율로 결합합니다. 제조업체의 지침( 재료 표)에 따라 15μL의 부피로 결찰 반응을 준비합니다.
   7. O/N을 20°C에서 배양하거나 주말 동안 4°C에서 배양합니다. 배양 후 T4 리가아제를 70°C에서 20분 동안 비활성화합니다.
   8. 결찰을 사용하여 전기천공에 의해 플라스미드를 대 장균 MC1061λpir 균주에 도입합니다. 전기 적격 박테리아와 2mm 간격 전기천공 큐벳을 사용하십시오.
3. 전기 적격 대장균 의 제조 및 pDM4 재조합 플라스미드의 전기천공
   1. 대 장균 MC1061λpir 균주의 단일 콜로니를 Luria-Bertani(LB) Miller 국물에 접종하고 200rpm 진영으로 30°C에서 O/N을 성장시킵니다.
   2. 박테리아 배양액 2mL를 LB 국물 18mL에 희석하고 광학 밀도(OD600)가 0.4-0.6에 도달할 때까지 30°C에서 진탕(200rpm)으로 배양합니다.
   3. 5,000 x g 및 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 박테리아 배양물을 펠릿화합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 냉각 증류 H₂O 40mL에 현탁합니다.
   4. 이 세척 단계를 두 번 더 반복하여 모든 배양 염을 제거합니다. 마지막으로, 펠릿을 냉각된 증류된 H₂O 4mL에 현탁시키고 현탁액 1mL를 4개의 원추형 1.5mL 미세분리기 튜브 각각에 옮깁니다.
   5. 14,000 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아 배양액을 펠릿화합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하고 각 펠릿을 100μL의 냉각 증류 H₂O에 현탁시킵니다.
   6. 3-3.5μL의 결찰 혼합물을 각 튜브에 첨가하고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 튜브의 내용물을 냉각된 2mm 갭 전기천공 큐벳으로 옮기고 2kV, 129 Ω 및 약 5ms의 시간 상수를 적용합니다.
      참고: 전기천공 큐벳을 얼음 위에서 예식시킵니다. 전체 절차 동안 박테리아를 얼음 위에 유지하십시오.
   7. 전기천공 후, 250μL의 SOC(이화산물 억제가 있는 Super Optimal 국물) 배지를 4개의 큐벳 각각에 첨가하여 내용물을 회수하고 배양 튜브(약 1mL)로 옮기고 30°C에서 진흔(200rpm)과 함께 1시간 동안 배양합니다.
   8. 클로람페니콜(25μg/mL)이 보충된 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트에 형질전환된 세포를 플레이트에 도금하여 플레이트에서 자라는 모든 콜로니가 플라스미드 백본을 갖도록 합니다.

표 1: null 돌연변이 생성에 사용되는 프라이머. 프라이머 B와 C의 겹치는 영역에는 밑줄이 그어져 있습니다. BamHI 사이트는 프라이머 A와 D로 굵게 표시되어 있습니다.

프라이머 이름	5'에서 3' 방향으로 시퀀스	사용 대상
A. 피시콜라 AH-3
A-Flgi1	CGCGGATCCGACTGTTACCCGTTTCAATCA	FGI 돌연변이
B-Flgi1	CCCATCCACTAAACTTAAACAGATCacctcgaactcgaaa
C-Flgi12	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGGAACCTTAAATGCCATGA
D-Flgi12	CGCGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
E-Flgi1	ACCCGCTTCATTCGCTAT
F-플리지12	TCCGATTTTCTGACTCAGGG
A-FGI4	CGCGATCCGATCGTACGCTAATATGAA	FGI-4 돌연변이
B-FGI4	CCCATCCACTAAACTTAAACACATATTATCTTGCCCCTGAT
C-FGI4	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGATGGAGCTAATCACTCGTTT
D-FGI4	CGCGGATC아카타트카아카카크
E-FGI4	ATTTCCCTGCCAAATACG
에프-FGI4	CCTGCCAACAGGATGTAAG
pDM4 벡터
pDM4를 위한	AGTGATCTTCCGTCACAGG	pDM4 벡터에 삽입
pDM4rev	AAGGTTTAACGG TTGTGGA

결과

그림 1: 염색체 영역 및 프라이머 설계의 생물정보학적 검출. (A) A. hydrophila AH-1 및 A. piscicola AH-3에서 확인된 염색체 영역 체계. A. hydrophila AH-1 편모 글리코실화 섬은 편모 글리칸이 슈다민산 유도체만 갖는 균주를 대표하며, A. piscicola AH-3 편모 글리코실화 섬은 편모 글리칸이 헤테로다당류인 균주를 대표합니다. 검은색으로 표시된 유전자는 슈다민산의 생합성에 관...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 사이클 시퀀싱 준비 반응 키트	어플라이드 바이오시스템	4337455	시퀀싱에 사용
AccuPrime Taq DNA 중합효소, 고충실도	인비트로젠	12346-086	AB, CD 및 AD 단편의 증폭에 사용
아가로스	콘다-프로나다이스	8008	DNA 전기영동에 사용
알칼리성 포스파타제, 송아지 장(CIAP)	프로메가	M1821	5' 말단에서 인산염을 제거하는 데 사용됩니다.
박토 한천	벡턴 디킨슨	214010	운동성 분석에 사용
밤하이	프로메가	R6021	엔도뉴클레아제 제한에 사용
블글II	프로메가	R6081	엔도뉴클레아제 제한에 사용
BioDoc-It Imagin 시스템	UVP		DNA 시각화에 사용되는 바이오 이미징 스테이션
Biotaq 중합효소	바이오라인	바이오-21040	콜로니 스크리닝에 사용
Cytiva illustra GFX PCR DNA 및 젤 밴드 정제 키트	시티비아	28-9034-71	PCR 앰플리콘 및 DNA 단편의 정제에 사용됩니다.
EDTA	응용	131026.1211	DNA 전기영동에 사용
전기천공 큐벳 2mm 간격	VWR	732-1133	변환에 사용
Luria-Bertani (LB) 밀러 한천	콘달랩	996	대 장균 배양에 사용
루리아 베르타니 (LB) 밀러 육수	콘달랩	1551	대 장균 배양에 사용
나노드롭 ND-1000	나노드롭 기술 Inc		DNA 정량화에 사용되는 분광 광도계
리팜피신	응용	A2220,0005	삼부모 짝짓기에 사용
SOC 매체	인비트로젠	15544034	전기천공 회수에 사용
T4 DNA 리가아제	인비트로젠	15224017	결찰 반응에 사용
Veriti 96 웰 열 순환기	어플라이드 바이오시스템		PCR 반응에 사용