게놈 트랜스포존 삽입을 통한 그람 음성 박테리아의 분리

초록

출처: Kazi, M. I., et. al., 고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에서 트랜스포존 삽입 라이브러리 생성. J. Vis. Exp. (2020년)

이 비디오는 카나마이신 내성을 기반으로 트랜스포존 삽입을 운반하는 그람 음성 수용자 박테리아의 선택, 정량화 및 보존을 보여줍니다.

프로토콜

최종 박테리아 돌연변이 라이브러리의 생성

1. 얼음 위에서 얼린 짝짓기의 분취량을 해동합니다.
2. 3.1단계에서 계산된 콜로니 형성 단위(CFU)를 기반으로 카나마이신이 보충된 150mm Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트에서 플레이트 짝짓기. 도금 전에 LB로 부피를 조정하여 150μL당 13,333개의 콜로니를 생성합니다.
   메모: 여기서 CFU 수는 약 10⁵ CFU/mL로 결정되었으므로 플레이트당 13,333개의 콜로니를 얻도록 짝짓기 부피를 조정했습니다. 이것은 플레이트를 과밀하게 만들지 않고 고해상도 돌연변이 라이브러리를 위해 30개의 플레이트에 최적의 콜로니 수를 제공할 것입니다.
3. 멸균 유리 구슬을 사용하여 카나마이신이 보충된 30 x 150mm Luria-Bertani 한천 플레이트에 플레이트당 희석액 150μL를 퍼뜨려 400,000개의 콜로니를 얻습니다(그림 1C).
   메모: 멸균 막대 또는 모든 종류의 멸균 살포기 도구(즉, 유리 구슬)를 사용하여 접시에 박테리아를 퍼뜨릴 수 있습니다.
4. 과도한 결합이 포함된 사용한 튜브는 폐기하십시오.
   메모: 동결/해동 주기는 박테리아 배양에 선택적 압력을 추가하여 Tn-seq 실험 결과를 왜곡할 수 있습니다. 매번 신선한 분취량을 사용하십시오.
5. 플레이트를 37°C에서 14시간 동안 배양합니다.
   메모: 배양 시간은 과성장(콜로니 접촉)을 방지하기 위해 최적화되어 있습니다. 배양 시간을 줄여 성장을 최소화하는 것이 좋습니다.

스토리지에 대한 라이브러리 밀도 및 풀링 추정

1. 각 플레이트의 CFU를 계산하여 트랜스포존 라이브러리의 총 돌연변이를 추정합니다. 최소 3개의 플레이트의 20%를 계산하여 전체 플레이트 그룹에 대한 콜로니 수 추정치를 결정합니다(그림 2A). 콜로니가 다른 콜로니에 닿지 않는지 확인합니다.
2. 예상 콜로니 수율을 계산한 후 각 플레이트에 3-5mL의 LB(또는 필요한 경우 그 이상)를 추가하고 멸균 스크래핑 도구를 사용하여 박테리아를 긁어냅니다. 메모: 멸균 접종 루프를 사용하여 플레이트를 효율적으로 긁었습니다.
3. 모든 플레이트의 박테리아 현탁액을 50mL 원추형 튜브에 모습니다(그림 1D). 이를 위해서는 최소 3개의 여러 개의 50mL 원뿔형 튜브가 필요합니다.
4. 펠릿 풀링된 박테리아 현탁액을 5,000 x g 에서 7분 동안 원심분리합니다.
5. 상청액을 버리고 30% 글리세롤이 보충된 LB 5mL에 펠릿을 재현탁합니다.
6. 트랜스포존 라이브러리 1mL를 냉동 바이알에 분취하고 -80°C에서 보관합니다.

결과

그림 1: 트랜스포존 돌연변이 라이브러리 구축의 개략도. (A) 박테리아 접합. 전위 기계를 암호화하는 "공여자" 균주가 "수용자" 균주와 혼합되었습니다. 혼합물을 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트에서 발견하고 1시간 동안 짝짓기를 허용했습니다. (B) 트랜스포존 라이브러리의 생성. 전위 기계를 운반하는 플라스미드는 "기증자" 균주에서 "수용자" 균주로 전달되었고, 트랜스포존은 "수용자" 균주의 게놈 전체에 무작위로 삽입...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
150mm x 15mm 페트리 접시	코 닝	351058
50mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	12-565-271
아시네토박터 바우마니 ATCC 17978	ATCC	해당 사항 없음	앰프, KanS
대장균 MFD Dap-	해당 사항 없음	해당 사항 없음	DAP Auxotroph는 성장하기 위해 600mM의 외인성 첨가 DAP가 필요합니다. 플라스미드 전달을 위한 RP4 기계가 포함되어 있습니다. JNW68용 캐리어(36).
외부 스레드 극저온 바이알	코 닝	09-761-71
유리구슬	코 닝	72684
글리세롤	피셔 사이언티픽	지33
접종 루프	피셔 사이언티픽	22-363-602	스크래핑 도구
카나마이신	피셔 사이언티픽	BP906	25 mg/L에서 사용
LB 한천, 밀러	피셔 사이언티픽	BP1425 시리즈
LB 국물, 밀러	피셔 사이언티픽	BP1426
인산염 완충 식염수, 10X 용액	피셔 사이언티픽	BP39920	1배로 희석