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1. 자연스러운 변화
메모: N315 유도체인 N2-2.1을 수혜자로 사용하였다. 이 균주에서 sigH 유전자좌는 SigH를 구성적으로 발현하도록 복제되었습니다. 전달할 저항 마커가 클로람페니콜이 아닌 경우 pRIT-sigH(CmR)를 사용하여 SigH를 발현할 수 있습니다. cfr 획득 S. aureus COL-45에서 정제된 플라스미드 또는 전체 DNA 추출물을 형질전환을 위한 기증자 DNA로 사용됩니다.
- 기증자 DNA 준비
- 32 mg/L 클로람페니콜이 보충된 50 mL의 트립신 콩 국물(TSB)이 들어 있는 300 ml 플라스크에서 37°C에서 진천하면서 COL-45를 밤새 배양합니다. 대조군 실험을 위한 플라스미드를 추출하기 위해 pHY300 플라스미드(TetR)를 운반하는 대장균 HST04를 배양합니다.
메모: HST04(dam-/dcm-)에는 DNA 메틸라아제 유전자가 없습니다. DNA 메틸화효소가 있는 다른 기존 균주도 DNA 메틸화 상태가 형질전환 효율에 영향을 미치지 않기 때문에 DNA 공여자를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 대안적으로, S. aureus COL 균주로부터 정제된 pT181 플라스미드는 형질전환 분석을 위한 양성 대조군으로도 사용할 수 있습니다. - 원심분리(4°C에서 10분 동안 8,000 x g )로 세포를 수집합니다.
- 플라스미드 DNA 추출 키트 또는 기존 DNA 정제 방법을 사용하여 플라스미드를 추출하여 전체 DNA를 정제합니다.
- 정제된 DNA를 분광계로 정량화하고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
메모: 형질전환 분석을 위해 일반적으로 1주일 미만의 신선한 DNA 제제를 사용하십시오. 오래된 DNA 제제는 형질전환의 효율성을 감소시킵니다.
- 변형 분석
- 수용 세포(N2-2.1)를 37°C에서 5ml의 TSB에서 진압하면서 밤새 배양합니다.
- 하룻밤 배양액 0.5ml를 1.5ml 튜브에 옮깁니다. 원심분리(4°C에서 1분 동안 10,000 x g )에 의해 세포를 침전시킵니다.
- 50ml 튜브에 10mL의 CS2 배지로 세포를 현탁시킵니다.
메모: CS2 배지는 S. aureus의 자연 형질전환 능력을 유도하는 완전한 합성 배지입니다. TSB 또는 뇌심장 주입(BHI)과 같은 다른 표준 실험실 배지는 형질전환에 적합하지 않습니다. - 후기 지수 단계(약 8시간)까지 37°C에서 흔들기(180rpm)와 함께 박테리아를 성장시킵니다.
- 원심분리(4°C에서 5분 동안 5,000 x g )로 세포를 수확합니다.
- 세포를 신선한 CS2 배지 10ml에 재현탁합니다.
- 정제된 플라스미드 또는 게놈 DNA 10μg(단계 1.1.4)을 세포 현탁액에 첨가합니다. 37°C, 180rpm에서 2.5시간 동안 흔듭니다.
메모: DNA와의 배양 시간(<2.5시간)이 짧을수록 형질전환 빈도가 낮아집니다. - 원심분리(4°C에서 5분 동안 5,000 x g )로 세포를 수집합니다.
- 세포를 10mL의 BHI 배지에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 녹인 BHI 한천(55°C) 보충제 90ml와 32mg/L 클로람페니콜(또는 대조군 실험에서는 5mg/L 테트라사이클린)을 혼합합니다. 혼합물을 90mm 페트리 접시에 붓습니다. 빠르게 식히고 한천을 굳히십시오.
- 플레이트를 37°C에서 2일 동안 배양합니다.
- 내성 특성을 확인하기 위해 콜로니를 적절한 항생제가 포함된 새로운 BHI 한천 플레이트로 옮겨 생성된 콜로니(형질전환체)를 복제합니다(이쑤시개 사용). 콜로니 PCR로 후천적 내성 유전자(cfr 또는 tetM)를 확인합니다.