C. elegans 유충의 병원성 박테리아 유발 사망률 평가

초록

출처: Anderson, Q. L., et al. 고처리량, 고함량, 액체 기반 C. elegans 병리 시스템. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 유전자 변형 C. elegans 유충이 마이크로플레이트에서 병원성 박테리아에 노출되는 액체 기반 분석을 보여줍니다. 배지에 분비된 박테리아 독소는 숙주 스트레스와 사멸을 유도합니다. 형광 염료는 죽은 벌레를 염색하여 이미징 기반 사망률 정량화를 통해 유전적 감수성 또는 내성을 평가할 수 있습니다.

프로토콜

1. 액체 사멸 분석 설정(기본 프로토콜)

메모: 이것은 하나의 박테리아 균주와 하나의 벌레 공급원에 대한 프로토콜입니다.

1. 세포 스크레이퍼를 사용하여 Slow Killing 또는 SK 플레이트에서 녹농 균을 제거하고 ~ 5mL의 S Basal에 재현탁합니다. 필요한 경우 확장합니다. 분광 광도계(OD₆₀₀)를 사용하여 박테리아 현탁액의 광학 밀도를 측정합니다.
2. OD₆₀₀ ≈ 0.09(최종 농도 3배)의 S Basal에 P. aeruginosa의 희석된 육수 24mL를 준비합니다. 웰당 최종 함량은 4.6.2를 참조하고 그에 따라 박테리아 희석량의 크기를 조정합니다.
3. 액체 Slow Kill 배지 21mL를 추가합니다(NaCl 3g, CaCl₂ 및 MgSO₄ 가 보충된 펩톤/L 3.5g을 최종 농도 1mM까지 함). 다중 채널 피펫을 사용하여 45μL의 박테리아와 배지를 384웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.
4. 웜을 소스에서 50mL 원추형 튜브로 세척하고 웜이 중력에 의해 가라앉도록 합니다. 상청액을 5mL로 흡인합니다. 총 50mL S 기저에 재현탁합니다.
5. 1.4단계를 두 번 반복합니다.
6. 웜 분류기를 사용하여 약 22마리의 웜을 384웰 플레이트의 각 웰에 분류합니다.
   메모: 이 설정은 각 웜을 ~1.1 μL의 액체에 떨어뜨립니다. 22개의 웜은 25μL에 달하여 총 분석 부피를 70μL/웰로 만듭니다.
   1. 각 웰의 최종 조성물은 70μL로 구성됩니다. 이 부피의 45μL를 박테리아 배지로 첨가합니다(0.03 OD 24 μL S Basal에₆₀₀ 개의 박테리아, CaCl₂ 및 MgSO₄가 보충된 21 μL SK). 나머지 25μL는 22개의 웜과 함께 추가됩니다.
   2. 여기에 사용된 분류기( 재료 표 참조)를 사용할 수 없는 경우, 웜을 S Basal에서 최종 농도 1 웜/μL로 희석하고 다중 채널 피펫을 사용하여 25 μL/웰로 피펫팅할 수 있습니다. 그러나 결과는 증가된 변동성을 나타낼 수 있습니다. 또는 Leung과 동료들이 설명한 대로 연동 액체 디스펜서를 사용할 수 있습니다.
7. 웜을 384웰 플레이트에 분류한 후, 플레이트를 가스 투과성 필름으로 밀봉하고 플레이트를 25°C에서 24 - 48시간 동안 배양합니다.
8. 원하는 시간에 마이크로플레이트 와셔를 사용하여 S Basal로 384웰 플레이트를 총 5회 세척합니다.
   1. 두 번째 세척 후, 대부분의 배지를 흡인하고 ~20μL를 남깁니다. 마이크로플레이트 와류기를 사용하여 플레이트를 최소 30초 동안 세게 흔들어 웰 바닥에서 파편을 느슨하게 합니다.
9. 최종 세척 후, 상청액을 20μL까지 흡인합니다. 0.7μM의 최종 농도를 위해 384웰 플레이트의 웰 50μL의 0.98μM 핵산 염색( 재료 표 참조)/웰을 추가합니다.
10. 실온에서 12 - 16시간 동안 배양합니다. 이 염료는 죽은 벌레만 염색합니다. 원하는 배양 기간이 지난 후 마이크로플레이트 와셔를 사용하여 플레이트를 세척하여 과도한 얼룩을 제거합니다(최소 3회 세척).
11. 데이터 수집을 위해 분광 광도계 또는 자동 현미경을 사용하여 투과광과 형광(531nm 여기 및 593nm 방출)을 모두 이미지화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
COPAS FP 바이오소터	유니온 생체 인식		대형 유세포 분석기/웜 분류기
세포 분석 5	바이오텍
EL406 세탁기 디스펜서	바이오텍
멀티트론 프로	인포어 HT
24 딥 웰 RB 블록	써모 피셔 사이언티픽	CS15124
384-웰 플레이트	그라이너 바이오-원	MPG-781091
선충 성장 배지(NGM)			리터당 양: 한천 18g, NaCl 3g, 펩톤 2.5g, CaCl₂ 1mL(1M), MgSO₄ 1mL(1M), 인산염 완충액 25mL, 밀리큐수 973mL
슬로우 킬링(SK) 플레이트			리터당 양: 한천 18g, NaCl 3g, 펩톤 3.5g, CaCl₂ 1mL(1M), MgSO₄ 1mL(1M), 인산염 완충액 25mL, 밀리큐수 973mL
슬로우 킬링(SK) 미디어			리터당 양: NaCl 3g, 펩톤 3.5g, CaCl₂ 1mL(1M), MgSO₄ 1mL(1M), 인산염 완충액 25mL, 밀리큐수 973mL
용해 양성 국물(LB)	USB생명과학	L1520
브라이언 하트 인퓨전 국물(BHI)	리서치 프로덕츠 인터내셔널 코퍼레이션	50-488-526
웜 표백제 용액			100mL당 양: 5M NaOH 용액 10mL, 5% 차아염소산나트륨 용액 20mL, 멸균수 70mL
S 기초			리터당 양: NaCl 5.85g, KH₂PO₄ 6g, K₂HPO₄ 1g, 밀리Q 물 1리터
한천	USB생명과학	A0930
나크롬	USB생명과학	S5000 시리즈
펩톤	USB생명과학	P3300
CaCl₂	USB생명과학
MgSO₄	피셔 사이언티픽	M63-500
인산염 완충액			리터당 양: K₂HPO₄ 132mL(1M) 및 KH₂PO₄ 868mL(1M)
KH₂PO₄	아크로스 오가닉스	7778-77-0
K₂HPO₄	USB생명과학	P5100
5% 차아염소산나트륨 용액	비카	7495.5-32
NaOH 솔루션	피셔 사이언티픽	SS255-1
쉽게 숨쉬세요	다각화된 생명공학	BEM-1
SYTOX 오렌지 핵산 염색	피셔 사이언티픽	S11368
박테리아 균주
녹농균 (PA14)
E. 페칼리스 (OG1RF)
대장균 슈퍼푸드 (OP50)
대장균 RNAi 발현 박테리아(HT115)
웜 균주
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP 리포터 (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)