RNAi 발현 박테리아의 배양 및 유지

초록

출처: Anderson, Q. L., et al., A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 표적 유전자 발현을 억제하기 위해 플라스미드를 운반하는 RNA 간섭(RNAi) 박테리아의 제조를 보여줍니다. 다운스트림 분석을 위한 dsRNA 발현 플레이트를 생산하기 위한 RNAi 박테리아 선택, 성장 및 유도 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. RNA 간섭(RNAi) 박테리아의 제조

1. 냉동 스톡에서 적절한 항생제(Ahringer 및 Vidal 라이브러리의 경우 100μg/mL의 카르베니실린 및 15μg/mL의 테트라사이클린)가 포함된 용원성 국물(LB) 한천 플레이트에 원하는 RNAi 함유 박테리아 균주를 줄무늬로 줄무늬로 옮기거나 핀 전사합니다.
   메모: 비병원성 박테리아로 작업할 때는 생물안전 수준(BSL)-2 A/B 생물학적 안전 캐비닛 또는 BSL-1 층류 후드를 사용하여 배양의 멸균성을 보장하고 라이브러리의 교차 오염 가능성을 최소화하십시오.
2. 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
3. 플레이트를 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.
   1. 2주 후 접시를 버리고 새로 만든 접시로 교체하십시오.
4. 각 클론의 단일 콜로니를 24웰 딥웰 플레이트의 단일 웰 또는 멸균 시험관에 있는 4mL의 카르베니실린 보충 LB에 개별적으로 접종하여 여러 RNAi 균주를 병렬로 테스트합니다.  
   메모: 테트라사이클린은 RNAi의 효율성을 감소시키는 것으로 보고되었습니다. 이 매체에서 사용하지 마십시오.
5. 24웰 딥 웰 플레이트를 멀티웰 플레이트에 최적화된 진영 인큐베이터에 넣고 950rpm으로 진동하면서 37°C에서 16시간 동안 배양합니다. 메모: 기존의 진탕 인큐베이터를 사용하여 멀티웰 플레이트에서 균일한 박테리아 성장을 얻기가 어렵습니다. 교황 인큐베이터는 배양균이 제대로 성장하기 위해 최소 750rpm에서 흔들 수 있어야 합니다. 특수 셰이커가 없으면 개별 튜브에서 각 배양액을 성장시킬 수 있습니다. 배양물은 나중에 원심분리를 위해 24웰 플레이트로 옮길 수 있습니다.
6. 2,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아를 수집합니다.
7. 플레이트를 뒤집고 세게 흔들어 상청액을 디캔팅합니다. RNAi 박테리아를 100μL의 S Basal(염화나트륨, NaCl 5.85g, 인산이칼륨 1g,_K2HPO₄; 인산일칼륨 6g, KH₂PO₄ 을 초순수 1L에 용해하고 오토클레이브로 멸균)에 재현탁합니다.
8. 피펫 재현탁된 박테리아를 멀티웰 NGM 플레이트(선충 성장 배지, 3 g NaCl, 2.5 g 펩톤, 1 mM 염화칼슘, CaCl₂; 1 mM 황산마그네슘, MgSO₄; 25 mL 인산염 완충액 (리터당 양: 132 mL의_K2HPO4 (1 M) 및 868 mL의_KH2PO4 (1M)) 및 물 리터당 한천 18g)에 IPTG(이소프로필β-D-1-티오갈락토피라노사이드; 1mM 최종 농도) 및 카르베니실린(100μg/mL 최종 농도)이 보충되었습니다.
   1. 6웰 플레이트의 웰당 3.5mL의 NGM 배지, 24웰 플레이트의 웰당 1mL 또는 96웰 플레이트의 웰당 150μL를 사용합니다.
   2. 6웰 플레이트의 경우 100μL/웰, 24웰 플레이트의 경우 50μL/웰, 96웰 플레이트의 경우 20μL/웰의 박테리아를 사용합니다. 말리십시오.
      메모: 건조는 일반적으로 빠르고 균일한 건조를 촉진하기 위해 멸균 흐름 후드에서 수행됩니다. 균일한 건조는 매우 중요합니다. 한천의 균열은 벌레의 굴을 파는 것을 촉진하므로 과도한 건조를 피하십시오. 이로 인해 웜 손실이 발생하고 액체 처리 시스템이 막힐 수 있습니다.
9. 준비된 플레이트를 즉시 사용하거나 나중에 사용할 수 있도록 최대 2 주 동안 4 °C에서 보관하십시오.
   메모: 접시가 마르는 것을 방지하기 위해 플라스틱 파라핀 필름으로 밀봉하거나 젖은 종이 타월과 함께 단단히 밀봉된 용기에 넣을 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24 딥웰 RB 블록	써모 피셔 사이언티픽	CS15124
선충 성장 배지(NGM)			리터당 양: 한천 18g, 염화나트륨 3g, 펩톤 2.5g, 염화칼슘 1mL(1M), 황산마그네슘 1mL(1M), 인산염 완충액 25mL, 밀리큐수 973mL
용해 양성 국물(LB)	USB생명과학	L1520
S 기초			리터당 양: 염화나트륨 5.85g, 인산일칼륨 6g, 인산이칼륨 1g, 밀리큐 물 1리터
한천	USB생명과학	A0930
소금	USB생명과학	S5000 시리즈
펩톤	USB생명과학	P3300
염화칼슘	USB생명과학
황산마그네슘	피셔 사이언티픽	M63-500
인산염 완충액			리터당 양: 인산이칼륨(1M) 132mL 및 인산일칼륨(1M) 868mL
인산일칼륨	아크로스 오가닉스	7778-77-0
인산이칼륨	USB생명과학	P5100