미세유체 챔버를 사용한 스트레스 하에서 박테리아 성장의 현미경 분석

초록

출처: Cayron, J., et al. 스트레스 치료 하에서 박테리아 성장에 대한 다중 규모 분석. J. Vis. 경험. (2019).

이 비디오는 스트레스 조건에서 박테리아 세포를 이미징하기 위해 미세유체 플레이트를 준비하고 사용하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 배양과 스트레스 유도 항생제 배지를 도입한 후 세포 로딩 및 현미경 설정을 도입하는 과정을 간략하게 설명합니다. 그런 다음 위상차 모드의 타임랩스 이미징을 사용하여 세포 분열 억제로 인해 DNA 함량이 증가한 길쭉한 사상형 세포의 발달을 관찰합니다.

프로토콜

1. 미세유체 타임랩스 현미경 이미징
   1. 미세유체 플레이트에서 보존 용액을 제거하고 미세유체 소프트웨어 사용 설명서에 설명된 대로 37°C로 예열된 신선한 배지로 교체합니다.
   2. 미세유체 플레이트를 매니폴드 시스템에 밀봉하고 프라이밍 버튼을 클릭합니다.
   3. 현미경 획득을 시작하기 전에 매니폴드 시스템이 있는 미세유체 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 37°C에서 ~2시간 동안 예열합니다.
      메모: 이 예열 단계는 미세유체 챔버 (microfluidic chamber) 의 팽창을 피하는 데 중요하며, 이는 타임랩스 실험 중 현미경의 초점을 변경하고 이미지 획득을 손상시킵니다.
   4. 미세유체 플레이트를 밀봉합니다. 웰 8의 배지를 150μL의 배양 샘플로 교체하고 웰 1에서 5까지의 배지를 스트레스 유도 시약이 있거나 없는 원하는 배지로 교체합니다.
   5. 미세유체 플레이트를 밀봉하고 현미경 스테이지에 놓습니다.
   6. 미세유체 소프트웨어에서 세포 로딩 절차를 실행합니다. 투과광에서 현미경으로 관찰하여 셀의 부하가 만족스러운지 확인하십시오. 챔버의 셀 밀도가 충분하지 않은 경우 셀 로딩 절차를 두 번째로 실행합니다.
   7. 투과광 모드에서 주의 깊게 초점을 맞추고 분리된 박테리아를 보여주는 여러 시야를 선택합니다. 시간 경과에 따른 분리된 세포의 성장을 모니터링할 수 있도록 과밀하지 않은 필드를 선택하는 것이 중요합니다(100μm²당 ~10-20개 세포 권장). 이것은 또한 이미지 분석 중에 세포 감지를 용이하게 합니다.
   8. 미세유체 소프트웨어에서 프로토콜 생성 버튼을 클릭합니다. 세포가 적응할 수 있도록 1-2세대 시간 등가되는 성장 배지 주입을 프로그래밍합니다(선택 사항). 그런 다음 2psi에서 10분 동안 스트레스 유도 배지를 주입한 다음 스트레스 처리의 원하는 기간 동안 1psi에서 주입합니다. 스트레스 후 세포의 회복을 분석하려는 경우 원하는 기간 동안 신선한 성장 배지의 주입을 프로그래밍하십시오.
      메모: 여기에 제시된 실험에서 세팔렉신을 2psi에서 10분 동안 주사한 후 1psi에서 50분 동안 주사했습니다. 그런 다음 신선한 성장 배지를 2psi에서 10분 동안 주입한 후 1psi에서 3시간 동안 주입했습니다.
   9. 투과광의 위상차와 필요한 경우 mCherry 신호에 대한 560nm 여기 광원을 사용하여 10분마다 1프레임으로 타임랩스 모드에서 현미경 이미징을 수행합니다.
      메모: 미세유체 주입 프로토콜의 시작과 동시에 현미경 이미지 획득을 시작하는 것이 중요합니다.

재료