의 연결을 성장 원뿔의 가시 끝이 시각화하고 F - 굴지 수치 방법을 설명합니다. 유리 coverslips에 culturing의 뉴런 후, 세포는 사포닌 함유 솔루션 permeabilized 있습니다. 그런 다음, rhodamine - 굴지 포함된 사포닌 버퍼와 짧은 부화는 무료 굴지 가시 종료에 형광 굴지 통합되어 있습니다.
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방법 논문
Permeabilized의 연결을 성장 콘스에서 Rhodamine - 굴지와 F - 굴지 이던가 엔드 레이블
이 논문에서
요약
초록
성장 axons의 운동성이있는 팁은 성장 콘이라고합니다. 성장 원뿔 성장 콘 수용체를 바인딩 및 역학과 성장 원추 cytoskeleton 3-6의 조직을 규제 로컬 표현 분자지도 단서과 상호 작용에 의해 개발 조직을 통해 axons 탐색 리드. 이러한 항해 신호의 주요 목표는 성장 콘 주변과 지속적인 굴지의 중합 및 동적 개조 7을 통해 해당 드라이브의 성장 콘 운동성을 가득 채우고 굴지의 필라멘트 meshwork입니다. 긍정적이든 매력적인지도 단서는 자극 굴지 필라멘트 (F - 굴지) 유인 큐의 원본 가까이있는 성장 콘 주변의 지역에서 중합에 의해 회전 성장 원뿔을 유도. 이 굴지의 중합은 최고의 여백과 유인 대한 axonal 신장 지역 성장 콘 돌출부, 접착시킵니다.
굴지 필라멘트 중합 충분한 굴지의 모노머의 가용성과 모노머의 추가를위한 중합 핵이나 굴지 필라멘트 가시 종료에 따라 달라집니다. 굴지 단량체는 여자가 망막 및 지느러미 루트 신경절 (DRG) 성장 콘에서 다량으로 사용할 수 있습니다. 무료로 F - 굴지 가시 엔드 모노머 추가를 위해 사용할 수있게되면 그 결과, 중합은 빠르게 증가합니다. 이것은 가까이 유인 80-10로 성장 원추 지역 계수 (ADF / cofilin)를 depolymerizing F - 굴지의 severing 단백질 굴지의 지역 활성화를 통해 여자는 DRG와 망막 성장 콘에서 발생합니다. 이 강한 ADF / cofilin 활동 중합을위한 새로운 F - 굴지 가시 종료를 만들 수 굴지의 필라멘트 서버스. 다음과 같은 방법이 메커니즘을 보여줍니다. F - 굴지의 총 내용은 형광 phalloidin와 얼룩의 시각이다. F - 굴지 가시 끝이 다른 운동성이있는 세포 11, 12의 이전 연구에서 적응하는 다음에 설명된 절차 permeabilized 아르 성장 콘 이내 rhodamine - 굴지의 결합에 의해 시각입니다. rhodamine - 굴지이 가시 엔드에 굴지의 모노머 추가에 대한 중요한 농도 이상의 농도에 추가되면, rhodamine - 굴지는 무료 끝이 가시로 조립. 매력적인 큐이 같은 성장 원뿔의 한쪽에 위치 micropipette에서 풀려나와 같은 그라디언트에서 제시하는 경우, F - 굴지 가시 종료에 rhodamine - 굴지의 설립은 micropipette 10쪽으로 성장 콘 측면에서 큰 것입니다 .
성장 원뿔은 작고 섬세한 셀 구조입니다. permeabilization, rhodamine - 굴지의 설립, 고정 및 형광 시각화의 절차는 모두 신중하게 수행하고 거꾸로 현미경의 무대에서 진행하실 수 있습니다. 이러한 방법은 마이 그 레이션하는 뉴런, 다른 기본 조직 세포 또는 세포 라인 지방 굴지의 중합을 연구에 적용할 수 있습니다.
프로토콜
rhodamine - 굴지 라벨 들어, 뉴런은 35mm 플라스틱 요리의 하단에 배치, 또는 "비디오"메뉴로 접착 coverslips에 유리 coverslips에 양식 있습니다.
1. Coverslips 또는 "동영상"요리 준비
- 많은 종류의 연결을 체외 기판에 접착제로 저조한 있습니다. 그들이 적절하게 청소하고 준비하지 않는 경우이 절차에 필요한 유리 coverslips는 충분한 신경 세포 - 기판 접착력을 허용하지 않을 수 있습니다. 유리 coverslips을 세척하고 청소 산성에 대한 자세한 절차는 뱅커와 고슬린으로 편집한 도서 Culturing의 신경 세포에 설명되어 있습니다. 또는 avidly 기판 분자를 바인딩 coverslips, 위해 nitrocellulose 코팅이 단계 1.7 아래 1.8에 설명되어 있습니다.
- 유리 coverslips (예 : 18mm의 사각형 또는 24mm 원)는 DH 2 O에 씻어서 유기 성분을 제거하는 드라이 열을 가능한 (≥ 225 ° C) 한 (며칠 최소 최대 3 개월 이상으로)에 구운 아르 화합물. 1.6 또는 1.3으로 진행 동영상 요리 단계로 이동합니다.
- 고해상도 videomicroscopy에 얇은 투명 ....
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토론
방법은 성장 원뿔을 마이 그 레이션의 리더 가장자리에있는 굴지의 cytoskeleton의 역동적인 리모델링에 관련된 세포 구성 요소의 시간적 및 공간적 해상도를 허용 여기를 발표했다. 신속하게 굴지 필라멘트 중합을 자극 NGF 또는 netrin 같은 유인 분자의 동작으로 그림 1과 2에 표시된 활성화 ADF / cofilin 10 굴지 필라멘트 severing 만든 굴지 가시 종료 현지 증가로 드러났습니다. 방법은 radixin, 그림 3과 4의 그림 음 단백질로 중재 성장 콘 chemotropic 응답에 관련된 다른 단백질의 지방화를 허용합니다. 이러한 방법은 또한 마이 그 레이션하는 뉴런, glial 세포 또는 다른 세포 유형에 굴지 기반 운동성의 규정을 분석 적용할 수 있습니다.
성장 원뿔 또는 기타 작은 운동성이있는 구조의 섬세한 성격이 방법의 사용에 큰 제한 사항입니다. 성장 원뿔 최고의 마진이나 세포의 유사한 운동성이있는 지역 굴지의 필라멘트와 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자 박사 제임스 밤버그 이러한 연구 협력에 대한 그의 연구실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 NIH의 보조금 HD19950, EY07133에 의해 그리고 미네소타 의료 재단 교부금에 의해 투자되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 18x18 mm 커버슬립 | Gold Seal | 3305 | |
| 35mm 페트리 접시 | Falcon BD | 351008 | |
| 아쿠아리움 시멘트 | DAP 100% 실리콘 아쿠아리움 밀폐제 | 모든 철물점 | |
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| 천연 마우스 laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen | A22281 | |
| Rhodamine 비근육 액틴 | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| F12 배양 배지 | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
참고문헌
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. ....
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