구배 억제제 플레이트를 사용한 박테리아 떼 평가

초록

출처: Guo, S., et al. 유도제 구배 플레이트에서 박테리아 표면 군집 운동성을 정량화합니다. J. Vis. 경험. (2022).

이 비디오는 다양한 억제제 농도에서 박테리아 떼 거동을 연구하기 위해 이중층 구배 떼 플레이트를 사용하는 방법을 보여줍니다. 바닥층에 구배 형성 억제제가 있는 플레이트에 박테리아를 접종하고 배양합니다. 박테리아 떼에 대한 억제제 농도의 영향을 분석하기 위해 일정한 간격으로 이미지를 캡처합니다.

프로토콜

1. 그라데이션 스웜 플레이트 준비

1. 떼 배지 준비
   참고: 군집 배지의 0.7%(w/v) 한천 농도가 이 프로토콜에 사용되었습니다.
   1. 두 개의 원뿔형 플라스크에 한천과 함께 용해 국물(LB) 분말을 준비합니다. 각 플라스크에는 트립톤 2g, 염화나트륨(NaCl) 2g, 효모 추출물 1g, 한천 1.4g이 들어 있습니다. 이중 증류수(ddH₂O)를 넣고 마그네틱 교반 바를 사용하여 현탁액을 저어줍니다. 추가 ddH₂₀₀O를 추가하여 최종 부피를 2mL로 조정합니다.
   2. 용액을 121°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다. 통풍구가 있는 통기성 캡이나 병 밀봉 필름을 사용하십시오.
      알림: 한천은 오토클레이브에서 가열하면 용해됩니다.
   3. 온도가 65°C로 떨어지면 용액을 혼합하여 균질성을 보장하고 배지를 65°C 인큐베이터 또는 수조로 옮겨 단기간 사용합니다.
2. 최하층 떼 배지의 준비
   참고: 최하층 배지는 군집 배지와 유도제 원액의 혼합물입니다. 유도제 구배 스웜 플레이트의 공식은 표 1에 나와 있습니다.
   1. 동결건조된 레스베라트롤 분말 114.12mg을 디메틸설폭사이드(DMSO) 5mL에 용해시켜 100mM 레스베라트롤 원액을 제조하고 용액을 -20°C에서 보관합니다.
   2. 6g의 아라비노스 분말을 30mL의_ddH2O에 녹여 20%(w/v) 아라비노스 원액을 준비합니다. 아라비노스가 용해될 때까지 10-15분 동안 기다리십시오. 용액을 실온에 보관하십시오.
   3. 65°C 인큐베이터에서 배지를 꺼내 실온에 두십시오. 삼각형 플라스크가 유지될 수 있을 만큼 식을 때까지(~50°C) 군집 배지를 식힙니다. 한천이 응고될 수 있으므로 군집 배지를 실온에 장기간 두지 마십시오.
   4. 필요한 부피의 유도제 원액을 50°C의 스웜 배지에 첨가합니다(표 1). 유도 용액을 붓는 대신 피펫을 사용하여 분배합니다. 부드럽게 소용돌이치면서 유도제를 스웜 배지와 혼합합니다.
      참고: 이 단계는 고압멸균할 수 없는 유도제에 대한 것입니다. 매체에 기포가 들어가지 않도록 주의하십시오.
3. 이중층 그라데이션 스웜 플레이트의 준비
   참고: 상층 배지는 0.7%(w/v) 한천을 함유한 LB 배지입니다.
   1. 13 x 13cm 정사각형 페트리 접시에 유도제 이름과 균주를 표시하고 접시를 뚜껑 가장자리 위로 받쳐 놓습니다(그림 1B).
   2. 50mL 피펫 또는 50mL 원심분리기 튜브를 사용하여 40mL의 따뜻한 바닥층 배지(50°C)를 추가합니다.
      참고: 또는 13 x 13cm 정사각형 페트리 접시의 경우 40mL 하층 및 상층 배지가 적합합니다. 10 x 10cm 정사각형 페트리 접시의 경우 25mL 하단 층과 상층 배지가 적합합니다.
   3. 층류 후드 내부에서 1시간 동안 덮지 않은 채 최하층 배지를 경화시킵니다. 배지가 굳는 동안 정사각형 페트리 접시를 방해하지 마십시오.
      참고: 최하층을 경화하는 동안 유도제를 포함하지 않는 군집 배지는 65°C 인큐베이터 또는 수조에 유지되어야 합니다.
   4. 바닥층이 완전히 굳으면 뚜껑을 제거하고 정사각형 페트리 접시를 층류 후드 안에 넣습니다.
   5. 50mL 피펫 또는 50mL 원심분리기 튜브를 사용하여 40mL의 따뜻한 상층 배지(50°C)를 추가합니다.
      참고: 상층 배지에는 유도제가 포함되어 있지 않습니다.
   6. 벤치탑의 이중층 플레이트를 경화시키고 1시간 동안 덮고 방해받지 않습니다. 준비된 플레이트를 4°C에서 최대 24시간 동안 보관합니다. 참고: 경화 시간이 길어지면 수분 함량이 감소하고 군집 운동성이 제한됩니다.

2. 대장균 K12 및 녹농균 PAO1의 성장

1. 트립톤 5g, NaCl 5g, 효모 추출물 2.5g을_ddH2O에 첨가하여 LB 배지 500mL를 준비하고 용액을 500mL까지 보충합니다. 용액을 121°C에서 20분 동안 액체 사이클에서 오토클레이브하고 4°C에서 보관합니다.
2. 트립톤 1g, NaCl 1g, 효모 추출물 0.5g 및 한천 1.5g을_ddH2O에 첨가하여 100mL의 1.5%(w/v) LB-한천 배지를 준비하고 용액을 100mL까지 채웁니다. 121°C에서 20분 동안 액체 사이클에서 용액을 오토클레이브합니다. 한천이 응고되는 것을 방지하기 위해 배지를 50°C 수조로 옮깁니다.
3. LB-한천 배지 플라스크를 잡기 편하면 25mL 피펫을 사용하여 페트리 접시(직경 10cm)에 20mL의 LB-한천 배지를 추가합니다. 플레이트를 실온에서 밤새 방치하고 LB-한천 플레이트를 4°C에서 보관합니다.
4. -80°C에 보관된 스톡 배양물, 일회용 접종 루프를 사용하여 LB-한천 페트리 접시에 줄무늬 대장 균 K12, 대 장 균 K12-YdeH, P . aeruginosa, PAO1 및 P. aeruginosa, PAO1-YdeH 균주를 채취합니다. 페트리 접시를 37°C에서 밤새 거꾸로 배양합니다.
5. 페트리 접시에서 다양한 균주에 대한 단일 콜로니를 선택하고, 각 콜로니를 5mL의 LB 배지에 접종하고, 220rpm으로 설정된 실험실 궤도 셰이커에서 37°C에서 배양합니다.
6. 배양 밀도가 OD600nm ~1.0에 도달하면 셰이커에서 배양액을 꺼내 실온에 두십시오. 3.2.1단계에 설명된 대로 배양 밀도를 OD600nm = 1.0으로 조정합니다.

3. 그래디언트 스웜 플레이트의 접종 및 배양

1. 접종 우물 준비
   참고: 표준 거리로 분리된 우물을 생성할 수 있는 3D 프린팅 커버 모델을 아래에 설명된 방법 대신 사용할 수 있습니다.
   1. 그림 1C와 같이 A4 용지에 웰 위치를 표시합니다. 하나의 정사각형 페트리 접시에 2개 또는 3개의 반복으로 3개의 테스트 농도를 설정합니다.
   2. 표시된 A4 용지를 응고된 그라데이션 플레이트 아래에 놓습니다. 100μL 피펫 팁의 넓은 면을 표시된 위치의 반고체 배지 표면으로 밀어 넣습니다. 피펫 팁이 상층 배지의 바닥에 도달할 때까지 누릅니다.
   3. 팁이 바닥에 닿으면 팁에 수직 힘을 가하지 마십시오. 팁을 부드럽게 돌려 원통형 웰의 내용물을 분리합니다.
   4. 따로 마련된 좁은 공간으로 공기가 흐를 수 있도록 피펫 팁을 매우 작은 거리를 따라 수평으로 움직입니다. 엄지와 중지를 사용하여 피펫을 잡고 검지로 팁을 눌러 팁 내부의 가스 흐름을 차단합니다.
   5. 팁을 수직으로 당겨 빼내면서 팁에 우물 내용물을 유지합니다.
      알림: 우물 내용물이 미끄러지면 검지로 약간 더 압력을 가하여 팁을 완전히 밀봉하십시오.
   6. 표시된 모든 위치에서 3.1.2-3.1.5단계를 반복합니다. 접종하기 전에 군집 플레이트를 덮으십시오.
2. 그래디언트 플레이트 접종 및 배양
   1. 하룻밤 성장 배양 밀도를 OD600nm = 1.0으로 조정합니다.
   2. 하룻밤 성장 배양액 80μL를 모든 웰에 피펫팅합니다. 박테리아 배양물을 우물 외부로 흘리지 마십시오.
   3. 밀봉 필름으로 플레이트를 감싸십시오. 장기간 관찰(3-5일)을 위해 멸균 실험실 고무 테이프로 플레이트를 감쌉니다.
      알림: 고무 테이프는 끊어질 가능성이 적습니다.
   4. 인큐베이터 내부의 습도를 유지하기 위해 ddH₂O로 채워진 비커를 인큐베이터에 놓습니다. 그래디언트 스웜 플레이트를 37°C에서 배양합니다.
      알림: 스웜 플레이트를 거꾸로 배양하지 마십시오. 이로 인해 박테리아 배양물이 우물에서 누출됩니다.
   5. 접종 직후 군집 플레이트를 이미지화하여 이를 0시간 시점으로 기록합니다.

4. 박테리아 표면 떼 이미징

1. 12시간마다 인큐베이터에서 한 번에 하나씩 스웜 플레이트를 꺼내 플레이트를 수평으로 잡고 겔 이미징 시스템에 넣습니다( 재료 표 참조).
   알림: 플레이트 표면에 지문을 남기지 마십시오. 깨끗한 장갑으로 군집 판의 측면을 잡습니다.
2. 젤 이미징 모드를 선택합니다. 군집 판을 백색광에 노출시키십시오. 초점 거리를 조정하여 떼를 가장 선명하게 볼 수 있습니다.
   참고: 주어진 배치의 모든 플레이트에 대해 동일한 초점 거리를 사용하십시오.
3. 노출 시간을 300ms로 조정하여 선명한 관찰을 위해 떼의 밝기를 향상시킵니다. 배경광의 간섭을 최소화하기 위해 임계값을 조정합니다.
   참고: 임계값은 겔 이미징 시스템의 작동 인터페이스에서 조정됩니다. 배경광의 간섭을 최소화하기 위해 왼쪽의 값을 늘립니다. 오른쪽의 값을 줄여 떼의 밝기를 향상시킵니다. 이 프로토콜에서 지역은 일반적으로 6,000에서 50,000 사이입니다.
4. 추가 분석을 위해 이미지 파일을 저장합니다. 이미징 시간, 유도제 유형, 기울기 방향 및 변형률을 .txt 파일에 기록합니다.

 

표 1: 이중층 군집 매체 사양.

상층 배지/용원성 육수 배지(100mL당)
트립톤: 1g
식염 화나트륨: 1g
효모 엑기스: 0.5g
한천:0.7g
최하층 배지/유도제 함유 배지(100mL당)
트립톤: 1g	작업 집중:	원액 농도:
식염 화나트륨: 1g
효모 엑기스: 0.5g	- 레스베라트롤: 400μM	- 레스베라트롤: 100mM
한천:0.7g
유도제:	- 아라비노스: 0.5%(w/v)	- 아라비노스: 20%(w/v)
- 레스베라트롤 원액: 400μL	또는 1%(w/v)
- 아라비노스 원액: 2.5mL 또는 5mL

결과

그림 1: 유도제 구배 스웜 플레이트 준비, 접종 및 배양의 개략도. (A) 37°C에서 박테리아 배양의 하룻밤 성장. (B) 이중층 유도제 구배 군집 플레이트의 워크플로. i) 정사각형 페트리 접시를 받칩니다. ii) 최하층 배지를 붓고 실온에서 응고시킵니다. iii) 정사각형 페트리 접시를 평평하게 놓고 상층 배지를 붓습니다. iv) 플레이트 경화. v) 표시된 위치에 해당하는 우물을 만듭니다. vi) 박테리아 배양을 우물에...

재료