재조합 단백질 생산 및 박테리아 유래 소포로부터의 회수

초록

출처: Streather, BR, et al. 대장균에서 재조합 단백질로 채워진 소포의 최적화된 생산 및 분석. J. Vis. 경험. (2023년)

이 비디오는 박테리아 소포에서 VNp(Vesicle Nucleating Peptide)로 태그된 재조합 단백질의 생산 및 분리를 보여줍니다. 유도제는 VNp 태그 단백질 발현을 유발하여 소포 형성 및 캡슐화를 유도한 다음 세포 용해 없이 효율적인 단백질 회수를 위해 원심분리 및 초음파 처리를 수행합니다

프로토콜

1. 세균 세포 배양 및 단백질 유도

1. T7 프로모터로부터 재조합 단백질 발현을 유도하려면 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 최대 20μg/mL(84μM)의 최종 농도까지 첨가합니다. 재조합 단백질 발현의 유도는 소포 생성을 위해 후기 로그 단계(즉, 일반적인 광학 밀도, 0.8-1.0의 OD₆₀₀ )에서 발생해야 합니다. ​
   메모: 유도 기간의 길이는 단백질마다 다를 수 있으며, 일부는 4시간에 최대 생산량에 도달하고 다른 일부는 밤새(18시간)에 도달합니다. 현재까지 최대 소포 수출은 하룻밤 배양에서 얻어졌습니다.

2. 재조합 소포 분리

1. 3,000 x g (4 °C)에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
2. 장기 보관을 위해 소포 함유 배지를 멸균하려면 제거된 배양 배지를 멸균 및 세제가 없는 0.45μm 폴리에테르설폰(PES) 필터에 통과시킵니다.
   메모: 소포 함유 여과액에서 생존 세포의 배제를 테스트하기 위해 용원성 국물(LB) 한천에 플레이트를 바르고 37°C에서 밤새 배양합니다.
3. 소포를 더 작은 부피로 농축하려면 멸균 소포 함유 배지를 멸균 및 세제가 없는 0.1μm 혼합 셀룰로오스 에스테르(MCE) 필터에 통과시킵니다.
4. 세포 스크레이퍼 또는 플라스틱 스프레더를 사용하여 0.5-1mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 멤브레인을 부드럽게 세척하여 멤브레인에서 소포를 조심스럽게 제거합니다. 새로운 미세분리기 튜브로 옮깁니다. ​
   메모: 정제된 소포는 멸균 배지 또는 PBS에 4°C에서 보관할 수 있습니다. 이러한 방식으로 효소 활성의 손실 없이 이러한 소포에 6개월 동안 저장된 재조합 단백질의 예가 있습니다.

3. 분리된 소포에서 가용성 단백질 방출

1. 단백질 함유 소포가 멸균 배지/완충액으로 분리되면 장치에 대한 적절한 일정(예: 6x 20초 온 및 끄기 주기)을 사용하여 소포 지질 막을 초음파 처리하고 소포 파편을 제거하기 위해 20분 동안 39,000 x g (4°C)에서 원심분리합니다. 메모: 삼투압 충격 또는 세제 처리는 소포를 부수는 대안으로 사용될 수 있지만 단백질 기능 및/또는 다운스트림 적용에 미치는 영향을 고려해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)	멜포드	367-93-1
용해 양성 국물(LB) / LB 한천	실험실 재고	NA	트립톤 10g/L; 10g/L NaCl; 효모 추출물 5g/L(한천 1.5g/L)
MF-Millipore 멤브레인 필터(0.1μm, MCE)	머 크	VCWP04700
Millipore Express PLUS 멤브레인 필터(0.45μm, PES)	머 크	HPWP04700
인산염 완충 식염수(PBS)	실험실 재고	NA