대장균의 F 플라스미드 전달 및 이중 항생제 선택

초록

출처: Erdogan, F.,et al., 박테리아 접합에 관여하는 전달 단백질의 서열 특이적 분석을 위한 접합 짝짓기 분석. J. Vis. 경험. (2017년)

이 비디오는 구조 플라스미드를 사용하여 기증자에서 수혜자 대 장균 세포로 F 플라스미드를 전달하고 이중 항생제 내성을 통해 형질전환체를 선택하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아 배양 혼합, 흔들림 없이 배양, 짝짓기 쌍 방해, 성공적인 플라스미드 전달을 확인하기 위한 선택적 배지에 도금하는 작업이 포함됩니다.

프로토콜

1. XK1200 기증자에서 MC4100 수혜자까지의 접합 짝짓기 분석

1. 한천 플레이트와 멸균 피펫 또는 루프의 글리세롤 스톡 또는 단일 콜로니의 세포를 사용하여 20μg/mL 클로람페니콜(Cm), 50μg/mL 카나마이신(Km) 및 50μg/mL 스트렙토마이신(Sm)이 포함된 5mL LB에 MC4100 세포를 넣고 20mL 멸균 용원성 국물(LB)에서 XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-유전자 세포의 O/N 배양을 준비합니다. 37 °C에서 200rpm 쉐이킹으로 배양을 배양합니다.
2. 동일한 항생제를 사용하여 멸균 LB 2mL에 각 O/N 배양액에서 개별적으로 1:70 희석액을 만듭니다. 모든 기증자 세포에 최종 농도 100mM의 포도당을 첨가합니다. 200rpm에서 흔들면서 37°C에서 중간 로그 단계(OD₆₀₀ 0.5-0.7)까지 세포를 성장시킵니다.
3. 원심분리(4°C에서 5분 동안 4,000 x g)하여 세포를 펠릿화하고, 상청액을 버리고, 저온 멸균 LB로 한 번 세척하여 항생제를 제거하고, 세포를 2mL 저온 멸균 LB에 재현탁합니다.
4. 이중으로 각 배양액 100μL를 멸균 LB 배지 800μL에 분취하고 흔들지 않고 37°C에서 1시간 동안 짝짓게 합니다.
5. 30초 동안 세포를 소용돌이치게 하여 짝짓기 쌍을 방해하고 추가 짝짓기를 방지하기 위해 10분 동안 얼음 위에 놓습니다.
6. 소용돌이 혼합물과 신선한 멸균 LB를 사용하여 형질전환체의 6회 희석액(^10-2 내지 ^10-7)을 준비합니다. 그림 1과 같이 50 μg/mL Sm 및 20 μg/mL Cm를 포함하는 한천 플레이트의 각 절반에 각 희석액의 10 μL 분취량을 발견하여 형질전환 접합체 MC4100 pOX38-Tc Δgene::Cm 세포를 선택합니다. 두 중복 혼합물에 대해 반복합니다. 해당 부위를 멸균 상태로 유지하고 화염 근처에서 작업하십시오. 플레이트 O/N을 37°C에서 배양합니다.

결과

그림 1: 접합에서 표적 유전자의 기능을 평가하기 위한 짝짓기 분석. 기증자 및 수혜자 세포는 각각 pK184-TraF 및 MC4100으로 형질전환된 대 장균 XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cm이었습니다. 생성된 형질전환접합체(MC4100 pOX38-Tc ΔtraF::Cm)는 Sm 및 Cm를 포함하는 플레이트에서 성장하여 접합 기능의 성공적인 회복을 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
페트리 접시	피셔 사이언티픽	FB0875713
항생제			최종 농도
클로람페니콜(cm)	피셔 사이언티픽	BP904-100	20 μg/mL
카나마이신 (km)	바이오베이직 주식회사	DB0286	50 μg/mL
스트렙토마이신(Sm)	피셔 사이언티픽	BP910-50	50 μg/mL