빛 활성화 플라빈 모노뉴클레오티드를 사용한 박테리아 비활성화

초록

출처: Cheng, C., et al. 리보플라빈-5'-인산염의 가시광선 광분해를 통한 병원체 비활성화. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 병원성 박테리아에 대한 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN)의 광독성 효과를 평가하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 배양은 증가하는 농도의 FMN에 노출되고 가시광선으로 조명되어 세포 구성 요소를 손상시키는 활성 산소종(ROS)을 생성합니다. 그런 다음 생존 박테리아를 정량화하여 용량 의존적 생존율 감소를 평가합니다.

프로토콜

1. FMN 광분해 후 황색포도상구균(S. aureus) 생존력(그림 1)
   1. 배양된 플레이트에서 S. aureus (BCRC 10451) 콜로니를 15mL 나사 캡이 있는 시험관에서 채취한 10mL의 용원성 국물로 전달합니다. 37°C의 셰이커에서 16시간 동안 배양합니다.
   2. 배양액 0.5mL를 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 멸균된 물을 원심분리기 튜브에 첨가하여 배양액을 600nm(OD₆₀₀)에서 광학 밀도 0.5로 희석합니다(~6 x 10⁷ 콜로니 형성 단위[CFU]/mL).
   3. 배양액 0.5mL를 1.5mL 원심분리관으로 옮기고, 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 디캔팅하여 세포 펠릿을 얻는다.
   4. 1mL의 리보플라빈-5'-인산염(또는 플라빈 모노뉴클레오티드; FMN) 완충 용액(인산칼륨 완충액[PB]에서 30, 60 및 120μM FMN)을 1.3단계와 같이 얻은 세포 펠릿에 대하고, 소용돌이. 조사된 대조군의 경우 PB 1mL만 추가합니다.
   5. 30μM FMN 및 PB 단독을 함유한 생균 세포 용액 각각 1mL를 유리관에 옮기고 10W/^m2 의 보라색광으로 30분 동안 조사합니다.
   6. 30, 60 및 120 μM FMN 및 PB 단독을 함유한 생존 가능한 박테리아 세포 용액 각각 1mL를 유리관에 옮기고 20 W/^m2 에서 청색광을 120분 동안 조사합니다. 120μM FMN을 함유한 1mL의 생존 가능한 박테리아 세포 용액으로 다른 유리관을 설치하고 20W/^m2 에서 60분 동안 청색광을 조사합니다.
   7. 1.5단계와 1.6단계에 설명된 대로 시험관을 설치하고 두꺼운 알루미늄 호일로 덮습니다. 이 튜브는 다크 컨트롤 역할을 합니다.
   8. 조사 챔버(및 어두운 대조군)를 30-120분 조사 기간 동안 9 ± 1°C의 차가운 방에 보관하십시오.
      메모: 컵 내부에 배치된 LED 칩이 조사 실험 중에 광반응 시스템을 가열할 수 있기 때문에 발광 다이오드(LED) 조명에서 방출되는 열은 무시할 수 없습니다. 따라서 실험은 9 ± 1°C로 유지되는 냉장실에서 수행되었습니다.
   9. 조사 후 각 반응 용액에서 0.2mL를 Luria 한천(LA) 플레이트로 옮깁니다. L자형 유리봉으로 접시 위에 박테리아를 펴고 37°C에서 하룻밤 배양합니다.
   10. 하룻밤 성장 후 S. aureus 의 생존 플레이트 수와 비활성화율을 계산합니다.

메모: S. aureus 의 비활성화율은 감소율로 계산되며, 이는 [1 -I/D]×100%와 같으며, 여기서 I 와 D 는 각각 조사된 샘플과 다크 컨트롤의 CFU 수를 나타냅니다. 감소율은 비활성화율의 음수 값으로 정의됩니다.

결과

그림 1: S. aureus 생존율 에 대한 FMN 광분해의 효과.감소율은 (A) 20W/^m2에서 120분 동안 청색광 조사 하에서 FMN 및 (B) 10W/^m2에서 30분 동안 보라색광 조사하에서 FMN으로 처리한 S. aureus의 불활성화율의 음수 값...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
파란색, 녹색 및 빨간색 LED 조명	Vita LED Technologies Co., 타이난, 대만		직류 12V 5050
디메틸 설폭사이드	Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트루이스	190186
적외선 온도계	Raytek Co. 캘리포니아주 산타크루즈	MT4
LB 국물	디프코 주식회사, 뉴저지
L-메티오닌	Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트루이스	1.05707
NBT	Bio Basic, Inc. 캐나다 온타리오주 마컴
전원 공급 장치	China tech Co., 대만 신베이시	YP30-3-2
리보플라빈 5'-인산염	Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트루이스	R7774
RNase	뉴잉글랜드 바이오랩스, Inc. 매사추세츠주 입스위치
태양광 발전량계	Tenmars Electronics Co., 타이베이, 대만	TM-207
황색포도상구균 아종 황색포도상구균	생물자원 수집 및 연구 센터(BCRC), 신주, 대만	10451
UV-Vis 광학 분광계	Ocean Optics, 더니든, 플로리다	USB4000
UV-Vis 분광 광도계	Hitachi High-Tech Science Corporation, 도쿄, 일본	U-2900
바이올렛 LED	Long-hui Electronic Co., LTD, 동관, 중국