활성 산소종 생성을 통한 빛 유도 박테리아 불활성화의 정량화

초록

출처: Cheng, C., et al. 리보플라빈-5'-인산염의 가시광선 광분해를 통한 병원체 비활성화. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오에서는 L-메티오닌, 니트로 블루 테트라졸륨(NBT) 및 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN)를 포함하는 완충 반응 혼합물에 보라색 광선을 조사하여 활성 산소종(ROS) 생성을 유도합니다. 이것은 박테리아 비활성화와 분광법으로 검출 가능한 포르마잔의 형성으로 이어집니다.

프로토콜

1. 황색포도상구균의 활성산소종(O₂•⁻) 검출

1. 황색포도상구균 샘플을 준비합니다.
2. 멸균수로 샘플의 박테리아 밀도를 600nm에서 0.5의 광학 밀도로 희석합니다(OD(광학 밀도)₆₀₀, ~6 x 10⁶ CFU(콜로니 형성 단위)/mL). 배양액 0.5mL를 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 디캔팅하여 세포 펠릿을 얻습니다.
3. L-메티오닌 0.1093g, NBT(니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드) 0.1g, FMN(플라빈 모노뉴클레오티드) 25mL(400, 240 또는 120μM)를 PB(인산염 완충액) 75mL에 첨가합니다. 적용된 반응물의 각 1mL에 대해 FMN, 메티오닌 및 NBT의 최종 농도는 각각 100(60 또는 30) × ^10-6 M, 7.3 × ^10-3 M 및 1.2 × ^10-3 M입니다.
4. 얻어진 세포 펠릿에 각 반응물 용액(즉, 다양한 FMN 농도)의 1mL를 첨가합니다. 10 W /^{m 2} 에서 10 분 동안 보라색 빛으로 용액을 조사합니다.
5. 혼합물을 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 디캔팅합니다. 환원된 NBT를 추출하기 위해 1mL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 펠릿을 재현탁합니다. 560nm의 흡광도에서 생성된 O₂•⁻ 종을 검출합니다.

재료