항생제가 함유된 고분자 스트립의 항균 효능 결정

초록

출처: Sekar, A., et. al., 약물 용출 물질의 종단 항균 활성을 결정하는 새로운 방법. J. Vis. 경험. (2023년)

이 비디오는 항생제에 노출된 박테리아 배양에서 감소하는 ATP 구동 발광을 정량화하여 항생제가 함유된 고분자 스트립의 항균 효능을 평가하기 위한 발광 기반 분석을 보여줍니다.

프로토콜

시간 의존적 항균 활성 연구 설정

1. 박테리아를 1mL의 TSB(트립신 대두 국물) 국물에서 밤새 배양합니다.
2. 하룻밤 동안 배양된 박테리아 현탁액을 멸균 MHB(Mueller-Hinton 국물)에서 10⁵ CFU/mL로 희석하고 실험을 시작하기 전에 발광 단위를 사용하여 생존 가능한 박테리아 수를 확인합니다.
3. 순수 UHMWPE(초고분자량 폴리에틸렌) 및 약물이 함유된 UHMWPE 스트립(3mm x 5mm x 10mm)을 3mL 주사기에 넣습니다.
4. 부착된 바늘을 통해 10⁵ CFU/mL를 함유한 MHB를 1.35mL의 MHB에 해당하는 1.5mL 표시까지 주사기에 끌어당깁니다(그림 1: 1단계).
5. 주사기 설정을 37°C의 진탕 인큐베이터(100rpm)에 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 및 7일( 그림 1: 2단계)까지 넣습니다.
6. 표시된 각 시점에서 주사기 설정을 꺼내고 100μL의 박테리아 현탁액에 대해 실시간 미생물 생존력 분석을 수행합니다(그림 1: 3-4단계).
   1. 흰색 불투명 바닥 96웰 플레이트를 사용하여 발광 기반 분석을 수행합니다.
   2. 100 μL의 희석된 박테리아 현탁액을 100 μL의 분석 시약과 혼합합니다.
   3. 준비된 96웰 플레이트 위에 알루미늄 호일로 덮인 뚜껑을 놓고 100rpm 흔들면서 5분 동안 배양합니다.
   4. Gen5 3.11 소프트웨어의 다음 설정을 사용하여 마이크로플레이트 리더로 즉시 발광을 측정합니다.
      1. 새로 만들기를 클릭하여 작업 관리자 창에서 프로토콜을 설정합니다.
      2. 플레이트 유형(Plate Type)의 드롭다운 메뉴에서 Costar 96 흰색 불투명(Costar 96 white opaque)을 선택합니다.
      3. Select Steps > Actions 메뉴에서 Read 를 클릭합니다.
      4. Read Method 창에서 Luminescence를 클릭합니다. Endpoint/kinetic 및 Luminescence fiber 옵션을 각각 read type 및 optics type에서 선택한 상태로 유지합니다. 확인을 클릭합니다.
      5. 읽기 단계 창에서 <기본값> 설정을 유지합니다(게인 = 135, 적분 시간 = 1초, 읽기 높이 = 4.5mm). 확인을 클릭합니다.
      6. 플레이트 배치 창이 실행될 준비가 된 것으로 나타납니다. 로드 플레이트 창에서 뚜껑 사용 상자를 선택하고 확인을 클릭합니다.
      7. 96웰 플레이트를 기계에 넣어 발광 값을 읽습니다.
7. 6시간, 1일, 2일, 3일 및 7일 시점에 대한 생존 가능한 박테리아 수를 결정합니다. 해당 표준 곡선을 사용하여 발광 단위에서 CFU(콜로니 형성 단위)/mL를 결정합니다.
8. TSA(트립신 대두 한천) 플레이트에 스프레드 플레이트 방법을 수행하고 35°C에서 밤새 배양하여 검출 한계 미만의 발광 값을 나타낸 샘플에 생존 가능한 박테리아가 없는지 확인합니다. 다음날 식민지가 있는지 확인하십시오.
9. 남은 박테리아 현탁액을 10,000 × g에서 10분 동안 원심분리하고 사용한 배지를 부드럽게 흡인합니다. 약물의 항균 활성으로 인해 펠릿이 육안으로 관찰되지 않는 튜브의 경우 보이지 않는 펠릿이 방해받지 않도록 튜브에 100μL를 남겨 둡니다(그림 1: 5단계).
10. 펠릿화된 박테리아를 신선한 MHB에 재현탁시키고 부착된 바늘을 통해 박테리아 현탁액을 동일한 주사기 설정으로 다시 끌어냅니다(그림 1: 6단계).

결과

그림 1: 실험 설정의 개략도.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ATCC 12600	American Type culture Collection, 버지니아, 미국
BacTiter-Glo 미생물 세포 생존율 분석	Promega Corporation, 미국	지8231
BD 박토 트립산 대두 국물(대두-카제인 소화 배지)	벡턴-디킨슨, 미국	BD 211825	미국 Fisher Scientific에서 구입
BD Luer-Lok 주사기 멸균용, 일회용, 3mL	BD, 미국	309657
BD 바늘 5/8인치 일회용, 멸균, 25 G	BD, 미국	305122
BD BBL 탈수 배양 배지: Mueller Hinton II 국물(양이온 조정)	벡턴-디킨슨, 미국	B12322	미국 Fisher Scientific에서 구입
BD Difco 탈수 배양 배지: 트립산 대두 한천(대두-카제인 소화 한천)	벡턴-디킨슨, 미국	DF0369-17-6	미국 Fisher Scientific에서 구입
겐타마이신 설페이트	Fujian Fukang Pharmaceutical Co., 푸저우, 중국
LSE 벤치탑 쉐이킹 인큐베이터	미국 뉴욕주 코닝
플레이트 리더(Synergy H1	Biotek, VT, 미국
셰이커 이노바 2100	뉴브런즈윅 사이언티픽, 뉴저지, 미국
UHMWPE	GUR1020, 셀라니즈, 텍사스, 미국
반코마이신 염산염	Fagron, 네덜란드	804148