단일 세포 박테리아 성장의 미세유체 패터닝 및 형광 기반 추적

초록

출처: Pioli, R., et al., 순차적 모세관 보조 조립을 통한 미생물 및 미립자의 패턴화. J. Vis. 경험. (2021년)

이 비디오는 무탄소 현탁액 및 제어된 흐름을 사용하여 미세유체 트랩에서 단일 형광 태그가 지정된 대장균(E. coli) 세포를 캡처한 다음 영양분을 첨가하여 미세 콜로니의 성장 및 형광 이미징을 유발하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 박테리아 패턴

1. 실험 하루 전, 대장균 (균주 MG1655 prpsM-GFP)의 집단을 성장시킵니다. 냉동 육수에서 직접 배양액을 접종하고 37°C의 셰이커 인큐베이터에서 용원성 국물(LB) 배지에서 밤새 성장시킵니다. 세포가 prpsM-GFP(녹색 형광 단백질) 플라스미드를 유지하도록 50μg/mL의 카나마이신을 첨가합니다.
2. 실험 당일 실험 몇 시간 전에 박스 인큐베이터(그림 1A)를 37°C로 설정하여 시작하기 전에 균일하고 안정적인 온도를 보장합니다. 그런 다음 현미경 스테이지(그림 1B,C)에 주사기 펌프와 가열된 유리판을 설치하고 박스 인큐베이터와 동일한 온도로 온도를 설정합니다.
   메모: 현미경(그림 1E)을 포함한 전체 시스템이 밀폐된 박스 인큐베이터는 채널이 매질로 세척될 때 전체 실험 전반에 걸쳐 균일하고 일정한 온도가 유지되도록 합니다.
3. 실험 90분 전에 미세유체 칩을 100% 에탄올(EtOH)으로 채워진 용기에 넣고 100% EtOH로 채널을 최소 10분 동안 세척합니다. 미세유체 칩을 진공 데시케이터에 넣고 최소 30분 동안 가스를 제거합니다. EtOH를 증류수로 교환하고 칩을 최소 30분 동안 진공 처리합니다. 미세유체 칩을 70°C의 오븐에 10분 동안 넣어 채널에 남아 있는 액체의 흔적을 제거합니다.
   메모: 이 단계는 배양 배지로 세척할 때 채널에 기포가 형성되는 것을 방지하는 데 필요합니다.
4. 1mL의 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산(MOPS) 배지(1x)를 원심분리기 바이알에 피펫팅하고 10μL의 0.132M 인산칼륨(K₂HPO₄)을 첨가합니다. 37°C 인큐베이터에서 하룻밤 배양액을 꺼내 100μL를 원심분리기 바이알에 분취하고 배양액을 2,300× g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 원심분리기 바이알에서 상청액을 부드럽게 피펫팅하고 0.015% v/v의 Tween 20 및 0.01% v/v의 인산칼륨이 포함된 신선한 MOPS 배지 1mL에 펠릿을 재현탁합니다.
   메모: 박테리아 현탁액의 일반적인 농도는 0.015-0.15 vol% 범위이며, 이는 확장되고 이동성 축적 영역의 형성을 보장하고 기판에 입자가 축적되는 것을 방지합니다. 하룻밤 배지를 신선한 배지로 교체하면 템플릿에 박테리아 필름이 방출될 위험이 최소화됩니다. 신선한 배지에 탄소원이 없기 때문에 주형 패터닝 중에 현탁액에서 세포가 자라는 것을 방지합니다. PDMS 템플릿에서 후퇴하는 액체의 접촉각이 30°에서 60° 사이의 최적 범위 내에 떨어지기 위해서는 현탁액 중 Tween 20의 0.015% v/v 농도가 필요합니다.
5. 박테리아 현탁액을 1mL 주사기에 넣고 미세유체 튜브를 통해 주사기를 칩에 연결합니다.
   1. 주사기와 튜브 사이의 연결을 고정하려면 외경 0.6mm의 바늘을 튜브에 직접 삽입하십시오. 채널을 가로질러 입구 근처에 남아 있는 현탁액이 흩어지는 것을 방지하려면 입구로 사용되는 구멍이 아닌 패터닝 공정 중에 출구로 사용되는 구멍(그림 2A-III)을 통해 신선한 배지를 세척하십시오.
   2. 주사기를 주사기 펌프에 장착하고 서스펜션이 트랩으로 템플릿 영역을 덮을 때까지 채널의 상류 부분에 위치한 입구를 통해 미세유체 칩에 현탁액을 주입합니다. 메모: 액체 주입 과정에서 공기는 채널의 다운스트림 끝에 위치한 배출구를 통해 빠져나갈 수 있습니다.
   3. 설명된 형상에서 80-100μm/min의 메니스커스 후퇴 속도에 해당하는 0.07-0.2μL/min의 유속으로 박테리아 현탁액(그림 2A-I)을 인출하도록 주사기 펌프를 설정합니다.
   4. 현미경 소프트웨어를 통해 패터닝 프로세스를 모니터링합니다.
      메모: 여기서, 10배 배율을 사용하여 템플릿의 후퇴하는 메니스커스를 모니터링하고, 20배 배율을 사용하여 개별 박테리아가 미세 가공된 트랩에 침착하는 것을 모니터링했습니다.
6. 템플릿이 세포로 패턴화되면(그림 2A-II), 인출 유속을 증가시켜 미세유체 채널을 빠르게 비우고 이전에 최소 30분 동안 가스를 제거하고 30°C에서 예열한 신선한 LB로 세척합니다.
7. 주사기 펌프를 2μL/min의 유속으로 설정하여 채널을 부드럽게 세척합니다. 채널이 채워지면 특정 실험 요구 사항에 따라 유속(15μL/min)을 증가시킵니다.
8. 원하는 배율과 시간 간격으로 성장하는 박테리아의 이미지를 획득합니다.

결과

그림 1: 미세유체 채널에서 순차적 모세관 보조 조립을 위한 플랫폼의 개략도. (A) 박스 인큐베이터. 박스 인큐베이터는 미세유체 채널 내부에서 균일하고 일정한 온도(여기서는 30°C)를 유지합니다. (B) 액체 현탁액이 적재된 주사기. 주사기는 주사기 펌프(표시되지 않음)에 의해 제어되며 패터닝 과정에서 액체의 움직임을 제어하는 데 사용됩니다. (C) 가열 유리판. 가열된 유리판은 미세유체 채널 아래에 배치되며 템플릿 전체에 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BD 10 mL 주사기(Luer-Lock)	BD	300912	신선한 용원성 국물을 미세유체 채널로 세척하는 데 사용됩니다.
박스 인큐베이터	라이프 이미징 서비스		채널의 균일하고 일정한 온도를 보장하는 데 사용됩니다.
원심 분리기	에펜도르프	5424 R	야간 용지를 새 최소 용지로 교체하는 데 사용됩니다.
원심분리기 바이알	에펜도르프	30120086	1.5 밀리리터
세토니 베이스 120	세토니 GmbH		주사기 펌프
H401-T-컨트롤러	오콜랩		가열 유리판의 컨트롤러
H601-니콘-TS2R-유리	오콜랩		가열 유리판
인슐린 주사기, U 100, 루어 포함	코단 메디컬 ApS	CODA621640	패터닝 과정에서 액체 현탁액을 빼내는 데 사용되는 1mL 주사기
LB 국물, 밀러(루리아-베르타니)	피셔 사이언티픽	244610	용원성 국물이 미세유체 채널로 플러싱됨
Masterflex 이송 튜브	마스터플렉스	HV-06419-05	0.020'' 내경, 0.06'' 외경
걸레(10배)	텍노바	M2101	milliQ 물로 10배 희석하여 하룻밤 배지를 대체하는 데 사용
니콘 이클립스 Ti2	니콘 인스트루먼트		현미경
인산이염기성 칼륨	시그마 알드리치	P3786	MOPS 1x에 추가
트윈 20	시그마 알드리치	P1379	패턴화 공정 중 최적의 후퇴 접촉각을 보장하는 데 사용됩니다.