혐기성 조건에서 생체 이용 가능한 수은을 검출하기 위한 박테리아 바이오센서 분석

초록

출처: Stenzler, BR et. al., 수은 및 카드뮴 검출을 위한 혐기성 바이오센서 분석. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 혐기성 조건에서 수은 이온의 생체 이용 분율을 정확하게 측정하기 위해 유전자 조작 박테리아 바이오센서를 사용하는 방법을 보여줍니다. 황산마그네슘의 농도를 변화시킴으로써 이 분석은 형광 강도의 변화로 표시되는 대로 바이오센서가 유리 수은 이온에 선택적으로 반응하도록 보장합니다.

프로토콜

1. 노출 분석

1. 플레이트 레이아웃 디자인.
   메모: 노출 분석을 시작하기 전에 모든 피펫팅 값을 계산하고 스톡을 준비해야 합니다.실험을 올바르게 설계하는 방법과 포함할 컨트롤은 텍스트에 자세히 설명되어 있습니다. 또한 혐기성 모니터에 표시된 혐기성 챔버에 산소가 있는 경우 실험을 시작해서는 안 됩니다.
2. 96웰 템플릿에 따라 플레이트 레이아웃을 설계합니다. 이를 통해 32개의 서로 다른 처리가 3개의 기술적 반복으로 실험을 실행할 수 있으며, 이는 바이알을 설정하기 위한 4 x 8 그리드로 가장 잘 표현됩니다( 그림 1 참조).

메모: 수은 유도 바이오센서 로 Hg 흡수에 대한 변수의 역할을 테스트할 때 각 변수에 대해 처리(바이오 센서 + 수은(Hg) + 변수 + 질산염) 및 처리 블랭크 (바이오센서 + 변수 + 질산염)의 두 가지 처리가 필요합니다. 구성 바이오센서 를 사용하여 세포의 생리학에 대한 변수의 역할을 테스트할 때 각 변수에 대해 치료 (바이오센서 + Hg + 변수 + 질산염)와 치료 블랭크 (바이오센서 + 변수 + Hg)의 두 가지 처리가 필요합니다. 수은은 카드뮴(Cd)으로 대체될 수 있습니다. Hg 또는 Cd는 검량선을 수행할 때 변수가 됩니다. 구성 및 유도성 바이오센서는 동시에 실행할 필요가 없습니다(동일한 플레이트 레이아웃에서). 마그네슘(가변)의 농도 범위를 테스트할 때 플레이트 레이아웃 및 해당 4 x 8 그리드에 대한 템플릿 예가 표 1에 나와 있습니다.

2. 분석 플레이트 레이아웃에 따라 4 x 8 그리드를 설정합니다.

1. 7mL 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 표준 바이알을 트레이에 넣습니다.
메모: PTFE 바이알은 사용하기 전에 산 세척 또는 열 멸균을 해야 합니다. 바이알 외부를 조작해야만 처리해야 합니다.

2. 각 바이알에 각 처리에 해당하는 노출 매체 부피를 추가합니다.
메모: 총 부피가 2,000 μL(2 mL)인 노출에서 추가된 노출 매체 는 다음과 같습니다: 노출 매체 μL = 2,000 μL – 처리(블랭크) μL. (예: 노출 매체 μL = 2,000 – 100 μL(바이오센서) – 40 μL(질산염) – 100 μL(Hg) – 100 μL(가변적(예: 황산마그 네슘, MgSO₄)) = 1660 μL). 테스트된 변수에 추가된 부피가 최종 부피의 5%(100μL)를 초과하지 않는지 확인하십시오.

3. 플레이트 레이아웃에 따라 테스트할 화학 변수의 용액의 해당 부피를 각 바이알에 추가합니다.

4. 최종 농도가 200μM (40-80μL)가 되도록 각 바이알에 질산염을 첨가합니다. 구성적 바이오센서 처리 블랭크에 대해서는 이 단계를 제외합니다.

5. 플레이트 레이아웃에 따라 Hg(변수 테스트 시 5 nM ) 또는 Cd(변수 테스트 시 300 nM )를 바이알에 추가합니다. 수은 유도성 바이오센서 처리 블랭크에 대해서는 이 단계를 제외합니다.

1. Hg를 사용할 때는 4-8μM 스톡을 취하여 잘 흔든다. 7mL PTFE 바이알의 노출 매체 에서 용액을 100-250nM 으로 희석하여 작동하는 Hg 용액을 만듭니다. 이 작업 용액에서 필요한 바이알에 Hg를 첨가하십시오. 이 경우 Hg의 검량선은 0에서 12.5nM 사이입니다.
메모: Hg 또는 Cd 생체이용률에 대한 변수의 영향을 테스트할 때 [Hg] 또는 [Cd]가 모든 처리에서 일정하게 유지되는지 확인하십시오. Hg 또는 Cd를 추가할 때 하나의 피펫 팁을 사용하되 바이알의 노출 매체를 만지지 마십시오.

수동으로 궤도 운동으로 흔듭니다.
메모: Hg 또는 Cd가 용액에서 종분화되는 데 필요한 시간에 따라 실험이 일시 중지될 수 있습니다. 한 시간 이상 방치하면 증발/오염을 방지하기 위해 PTFE 바이알에 PTFE 캡을 씌우십시오.

균질성을 보장하기 위해 Biosensor 스톡을 앞뒤로 부드럽게 피펫팅합니다. 각 바이알에 100μL의 바이오센서 스톡 을 추가합니다. 수동으로 궤도를 흔듭니다.

다음 기준에 따라 판독을 위해 예열되도록 플레이트 리더를 준비합니다: 37°C의 온도, 판독 사이에 궤도 흔들림과 함께 2.5-5분마다 판독으로 10시간 동안 동역학 실행, 440nm의 형광 여기 및 500nm의 방출로 형광 측정.

4 x 8 그리드의 각 PTFE 바이알에서 200μL 를 96웰 플레이트(검은색, 96웰 투명 바닥 비결합 표면 마이크로플레이트)의 해당 웰에 피펫팅합니다. 각 200μL를 옮기기 전에 앞뒤로 5번 피펫팅합니다. 참고: 피펫 팁을 버리는 대신 피펫 팁을 PTFE 바이알에 그대로 두어 피펫팅 진행 상황을 추적하십시오.

96웰 플레이트를 플레이트 리더의 트레이에 넣은 다음 96웰 플레이트에 뚜껑을 덮고 분석을 시작합니다.

 

표 1: 바이오센서를 사용하여 마그네슘(0-10mM)의 구배에 걸쳐 Hg 생체이용률(5nM)을 테스트하기 위한 플레이트 레이아웃의 예

1

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a

Hg 유도 바이오센서 + Hg + 질산염 + 0 mM Mg

Hg 유도 바이오센서 + 질산염 + 0 mM Mg

구성 바이오센서 + Hg + 질산염 + 0 mM Mg

구성 바이오센서 + Hg + 0 mM Mg

b

Hg 유도 바이오센서+ Hg + 질산염 + 0.1 mM Mg

Hg 유도 바이오센서 + 질산염 + 0.1 mM Mg

구성 바이오센서+ Hg + 질산염 + 0.1 mM Mg

구성 바이오센서 + Hg + 0.1 mM Mg

c

Hg 유도 바이오센서 + Hg + 질산염 + 1 mM Mg

Hg 유도 바이오센서 + 질산염 + 1mM Mg

구성 바이오센서 + Hg + 질산염 + 1 mM Mg

구성 바이오센서 + Hg + 1 mM Mg

d

Hg 유도 바이오센서 + Hg + 질산염 + 10 mM Mg

Hg 유도 바이오센서 + 질산염 + 10 mM Mg

구성 바이오센서 + Hg + 질산염 + 10 mM Mg

구성 바이오센서 + Hg + 10 mM Mg

재료