비색 분석을 이용한 박테리아 막 결합 피로포스파타제의 스크리닝 억제제

초록

출처: Vidilaseris, K., et al. Thermotoga maritima 막 결합 피로포스파타제 억제제에 대한 스크리닝. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 오르토인산염 방출을 정량화하여 박테리아 막 결합 피로포스파타제(mPPase)의 억제제를 스크리닝하기 위한 비색 분석을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 잠재적인 항균 약물 표적인 Thermotoga maritima에서 mPPase를 억제하는 화합물을 식별할 수 있습니다.

프로토콜

1. 분석 준비용 시약

1. 아소산염-구연산염 용액을 준비합니다.
   1. 아소산나트륨 5g과 구연산삼나트륨 이수화물 5g의 무게를 달아줍니다.
      주의: 아소산나트륨은 독성이 있습니다. 따라서 적절한 보호 장비를 사용하고 특별한 주의를 기울여 다루십시오. 예방 조치로 필요한 모든 안전 예방 조치를 읽고 이해하기 전에는 취급하지 마십시오. 화합물 또는 그 용액의 먼지/증기를 흡입하지 않도록 퓨ム 후드에서만 취급하십시오. 흡입한 경우 신선한 공기로 이동하여 의사의 진료를 받으십시오. 적절한 화학 안전 고글, 보호 장갑 및 의복을 착용하여 섭취 및 눈/피부 접촉을 피하십시오. 삼킨 경우 즉시 독극물 센터나 의사/의사에게 연락하십시오. 피부나 눈에 묻은 경우 다량의 물로 씻고 의사의 진료를 받으십시오.
   2. 물 100mL에 녹입니다.
   3. 빙초산 5mL를 넣고 섞은 후 물을 250mL에 첨가합니다.
   4. 빛으로부터 보호된 실온에서 보관하십시오.
      메모: 이 솔루션은 1년 이상 안정적입니다.
2. 용액 A와 용액 B를 준비합니다.
   1. 용액 A의 경우 얼음처럼 차가운 0.5M HCl(염산) 10mL를 아스코르브산 0.3g에 첨가합니다. 소용돌이에 의해 아스코르브산을 용해시킵니다.
   2. 용액 B의 경우 70mg의 암모늄 엡타몰리브덴트 사수화물에 얼음처럼 차가운 물 1mL를 넣고 소용돌이치게 하여 용해시킵니다.
      메모: 사용할 때까지 두 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 분석 결과의 일관성을 위해 두 용액 모두 최대 1주일 동안 얼음 위에 보관할 수 있습니다.
3. 교정을 위해 0 μM, 62.5 μM, 250 μM 및 500 μM의 농도로 인산염(Pi) 표준물질을 준비합니다.
   1. 0 μL, 25 μL, 50 μL 및 100 μL의 5 mM Na₂HPO₄ (인산이나트륨) 이수화물을 370 μL의 반응 혼합물을 포함하는 4개의 마이크로튜브에 첨가합니다.
   2. 최대 1mL의 물을 채웁니다.

2. 하나의 96웰 플레이트에 대한 활성 분석

메모: 분석의 개략적인 워크플로우는 그림 1 을 참조하십시오.

1. 용액 A 10mL에 용액 B 1mL를 첨가하고 와류에 의해 혼합한 후 얼음 위에 보관합니다.
   메모: 이 용액은 투명하고 노란색이어야 합니다. 사용하기 전에 용액 A + B를 최소 30분 동안 얼음 위에 보관하십시오. 단, 장기간 보관하면 상할 수 있으므로 3시간 이내에 용액을 사용하십시오.
2. 멀티채널 피펫을 사용하여 40μL의 0μM, 62.5μM, 250μM 및 500μM Pi 표준물질을 튜브 스트립에 세 번씩 추가합니다.
   메모: Pi가 첨가되지 않은 반응 혼합물은 블랭크로 사용됩니다.
3. 다중 채널 피펫을 사용하여 튜브 스트립에 25μL의 복합 용액을 추가합니다.
   메모: 각 화합물은 세 가지 농도로 삼중으로 나뉘며, 이는 절반 최대 억제 농도(IC50)의 초기 추정에 충분합니다. 보다 정확한 IC50 측정을 위해 8가지 화합물 농도를 사용할 수 있습니다. 억제되지 않은 효소의 경우 복합 용액을 같은 양의 물로 대체합니다. 양성 대조군으로 2.5μM, 25μM 및 250μM의 이미도디인산(IDP) 나트륨염을 사용했습니다.
4. 다중 채널 피펫을 사용하여 15μL의 mPPase(막 결합 피로포스파타제) 용액 혼합물을 튜브 스트립(Pi 표준이 포함된 튜브 제외)에 추가합니다.
5. 접착 밀봉 시트로 튜브 스트립을 밀봉합니다. 밀봉 시트를 잘라 각 튜브 스트립을 분리합니다.
6. 샘플을 71°C에서 5분 동안 사전 배양합니다. 후속 단계 중 시간 소비를 최소화하기 위해 각 스트립 사이에 20초 간격으로 샘플을 가열 블록에 놓습니다.
7. 각 스트립에 대해 접착 밀봉을 엽니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 10μL의 2mM 피로인산이염기성 나트륨을 추가하고 5× 동안 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 동일한 밀봉을 사용하여 튜브 스트립을 다시 밀봉합니다.
   메모: 이 단계는 처음에는 20초 안에 완료하기 어려울 수 있습니다. 그러나 몇 가지 분석 후에는 더 쉬워질 것입니다.
8. 71°C에서 5분 동안 배양합니다.
9. 각 스트립 사이에 20초 간격으로 냉각 장치에 샘플을 놓습니다. 10분 동안 식히되 5분 동안 냉각한 후 각 스트립을 잠시 원심분리하여 밀봉 시트 아래에 물방울을 디캔팅한 다음 냉각 장치에 다시 넣고 밀봉을 제거합니다.
   메모: 냉각 장치는 물을 채운 폴리스티렌 페트리 접시(크기 150mm × 15mm)에 96웰 PCR(중합효소 연쇄 반응) 플레이트를 놓고 최소 1시간 동안 냉동하여 간단히 만들 수 있습니다. 장치는 분석 시작 약 5분 전에 냉동실에서 꺼내야 합니다. 시료 냉각 직전에 냉각 장치를 꺼내면 반응 혼합물이 얼고 발색을 방해할 수 있으므로 꺼내지 마십시오.
10. 10분 냉각 후 용액 A + B 60μL를 첨가하고 5× 동안 위아래로 피펫팅하여 혼합한 다음 튜브 스트립을 냉각 장치에 10분 동안 유지합니다.
11. 90μL의 아소산염-구연산염 용액을 첨가하고 실온에서 최소 30분 동안 유지하여 안정적인 파란색을 생성합니다.
    주의: 독성으로 인해 아소산나트륨을 함유한 모든 용액은 항상 각별한 주의를 기울여 취급해야 합니다. 따라서 비소산염-구연산염 용액의 첨가는 흄 후드에서 수행해야 합니다.
12. 각 반응 혼합물 180μL를 투명한 96웰 폴리스티렌 마이크로플레이트에 분배합니다.
13. 마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 860nm에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다.

결과

그림 1: 96웰 플레이트 형식의 TmPPase 억제 분석의 개략적인 워크플로우. 빨간색 번호는 프로토콜에 따른 분석 단계를 나타내고 파란색 화살표는 간격 순서를 나타냅니다. TmPPase: 호열성 박테리아 Thermotoga maritima의 mPPase.

재료