박테리아 포자 내막의 발아 단백질 시각화

초록

출처: Wen, J., Pasman, et. al., Bacillus subtilis 포자의 제르미노솜 및 내막 시각화. J. Vis. Exp. (2019년)

이 비디오는 박테리아 포자 내에서 발아 단백질의 조직을 밝히는 3차원 형광 이미지를 획득하기 위해 구조화된 조명 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 발아 단백질 이미징(타이밍: 1시간)
   1. 100x 오일 대물렌즈(개구수 = 1.49), CCD(전하 결합 소자) 카메라 및 이미지 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)가 장착된 구조화 조명 현미경( 재료 표 참조)에서 포자의 투과 및 형광 이미지를 캡처합니다.). 주변광의 방해 없이 실온에서 모든 이미지를 생성합니다. 이미징하기 전에 항상 100x 대물렌즈와 슬라이드를 75% 에탄올로 청소하십시오.
   2. 100nm(직경) 형광 마이크로스피어에 초점을 맞추고 대칭 psf를 얻을 때까지 100x 대물렌즈의 보정 링을 조정하여 점 확산 함수(psf)를 최적화하여 이미지의 흐림을 최소화합니다. psf는 임펄스 응답 또는 점 소스 또는 점 물체에 대한 이미징 시스템의 응답입니다.
   3. 약 10개의 둥근 형광 마이크로스피어가 있는 시야를 선택합니다. 이미지 분석 소프트웨어의 가이드로 561nm 및 488nm 여기 파장 모두에 대한 격자 초점 조정을 적용합니다.
   4. 투과광으로 포자의 초점을 맞추고 각 이미지에 대해 200ms 노출로 16× 평균 모드에서 투과광 이미지를 캡처합니다.
   5. 조명 모드 "3D-SIM", 판독 모드 전자 증배(EM) 이득 14비트, EM 이득 175로 카메라 설정을 사용하여 포자의 3D-SIM 원시 형광 이미지를 캡처합니다. PS4150 포자의 FM4-64 프로브를 20% 레이저 출력과 400ms의 조명 시간에서 561nm 레이저 광으로 여기시킵니다.
   6. KGB80 포자에서 GerKB-mCherry 및 GerD-GFP를 각각 1초 동안 30% 레이저 출력에서 561nm 레이저 광, 3초 동안 60% 레이저 출력에서 488nm 레이저 광으로 여기시킵니다. Z-Stack 설정은 위에서 아래로 모드, 0.2μm/단계입니다.
      메모: 이러한 레이저 매개변수는 히스토그램 창에 대해 약 4,000의 최대 밝기 값을 보장하기 위해 적용되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
공기 건조 유리 슬라이드	멘젤 글레저	630-2870
APO TIRF N20R8 100× 오일 대물렌즈(NA=1.49)
바실러스 서브틸리스 KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-m체리 캣, gerD-gfp 칸)
바실러스 서브틸리스 PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
FluoSpheres 카르복실레이트 변형 마이크로스피어	인비트로젠, 0.1 μm	F8803
FM4-64	써모 피셔 사이언티픽	F34653
Histodenz 비이온 밀도 구배 배지	시그마-알드리치	D2158
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