박테리아 먹이 지원을 통한 전기천공법을 통한 야생형 아메바의 형질감염

초록

출처: Paschke, P., et al. 박테리아에 대한 선택 및 성장에 기반한 Dictyostelium discoideum 세포의 유전 공학. J. Vis. Exp. (2019).

이 비디오는 표적 유전자를 운반하는 플라스미드를 전기천공을 통해 아메바 세포에 도입한 후 박테리아 보충제에서 회수하여 야생형 아메바에서 효율적인 유전자 전달을 가능하게 하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 형질감염을 위한 Dictyostelium 세포 설정
   1. Klebsiella aerogenes를 RT(실온)에서 밤새 SM(탈지유) 배지(영양이 풍부한 배지)에서 합류하도록 성장시킵니다. 배양액은 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
   2. 이 박테리아 현탁액의 약 400μL를 SM 한천 플레이트(펩톤 10g/L; 효모 추출물 1g/L; 포도당 10g/L; KH₂PO₄ 1.9g/L; K₂HPO₄ x 3 H₂O, 1.3g/L; MgSO₄ 무수 0.49g/L; 1.7% 한천)을 고르게 펴 바릅니다. 멸균 루프를 가져와 Dictyostelium 세포를 접종합니다. 플레이트의 한쪽 가장자리에 셀을 퍼뜨립니다.
   3. 형질감염을 위해 충분히 큰 성장 영역을 보장하기 위해 플레이트를 22°C에서 2일 동안 배양합니다.
      메모: 큰 성장 영역(예: Ax3, DH1 또는 JH10)을 만들지 않는 Dictyostelium 균주 또는 경험이 없는 실험자의 경우 대신 클리어링 플레이트를 사용하십시오.
   4. 멸균 루프를 가져와 Dictyostelium 세포(약 2-4 x 10⁵ 세포)를 접종합니다. 세포를 SM에서 밀도가 높은 K. aerogenes 현탁액 800μL로 옮깁니다. 위아래로 피펫팅하여 세포를 혼합합니다.
   5. 400 μL, 200 μL, 100 μL 및 50 μL를 신선한 SM 한천 플레이트에 옮깁니다. 모든 플레이트에 400μL의 추가 SM K. aerogenes 현탁액을 추가하고 고르게 펴고 건조시킵니다.
   6. 플레이트가 반투명해질 때까지 플레이트를 22°C에서 약 2일 동안 배양합니다.
      메모: 더 빠른 성장 속도로 인해 박테리아는 처음에는 합류하는 잔디밭을 생성하고 아메바는 나중에 박테리아의 판을 "제거"합니다. 이 과정에 필요한 시간은 균주 배경과 박테리아에서 성장하는 돌연변이 세포의 능력에 따라 달라질 수 있습니다.

2. 박테리아 선택에 기반한 Dictyostelium 세포의 형질감염

1. K. aerogenes 현탁액으로 플레이트를 준비하려면 K. aerogenes 박테리아를 함유한 SorMC 완충액 10mL를 OD(광학 밀도)₆₀₀ = 2의 밀도로 추가합니다(원하는 박테리아 농도를 위해 준비된 OD₆₀₀ = 100 K. aerogenes 원액 200μL 추가) 10cm 조직 배양 처리 페트리 접시에 넣습니다.
   메모: 이 플레이트는 나중에 형질감염된 D. discoideum 세포를 배양하는 데 필요합니다. 또는 6웰 조직 배양 플레이트를 사용할 수 있습니다. 염색체외 플라스미드의 형질감염의 경우 6웰 조직 배양 플레이트가 더 자원 효율적입니다. 웰당 2mL의 K. aerogenes SorMC(OD₆₀₀ = 2) 현탁액을 사용합니다.
2. Dictyostelium 세포의 준비
   1. 10μL 일회용 접종 루프를 사용하여 배양 플레이트(제거된 영역의 가장자리) 또는 제거 플레이트의 성장 영역(약 3cm)에서 세포를 긁어냅니다. 세포를 1mL의 얼음처럼 차가운 H40 완충액이 들어 있는 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
      메모: 클리어링 플레이트에서 세포를 수확하는 시기가 중요합니다. 너무 일찍 수확하면 세포의 양이 너무 적고, 늦게 수확하면 부분적으로 발달한 세포가 생성될 위험이 높아집니다.
   2. 1,000 x g 에서 2분 동안 회전하거나 10,000 x g에서 2초 동안 플래시 회전하여 세포를 세척합니다. 상청액을 버리고 세포를 H40 완충액에 2-4 x 10⁷ cells/mL의 최종 밀도로 재현탁합니다. 전체 형질감염 절차 동안 세포를 차갑게 유지하십시오. 얼음물 슬러리를 사용하여 튜브와 얼음이 직접 접촉하도록 합니다.
3. 전기천공
   1. 1-2μg의 DNA(데옥시리보핵산)가 들어 있는 튜브에 100μL의 세포를 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 조심스럽게 혼합합니다.
   2. 세포/DNA 혼합물을 사전 냉각된 전기천공 큐벳(2mm 간격)으로 옮깁니다.
   3. 350V, 8ms, 2펄스 및 1초 펄스 간격의 구형파 설정을 사용하여 셀을 펄스합니다.
      메모: 2μg 이상의 DNA를 첨가하지 마십시오. 더 많은 양은 세포에 독성이 있으며 형질감염 효율을 감소시킵니다. 추가된 총 DNA 부피는 5μL를 초과해서는 안 됩니다.
   4. K. aerogenes SorMC가 있는 이전에 준비된 10cm 페트리 접시로 세포를 즉시 옮기고 세포가 5시간 동안 회복되도록 합니다.
      메모: 도립 현미경으로 페트리 접시의 세포를 확인하십시오. 세포는 전기천공 직후 둥글게 보이지만 표면에 제대로 부착할 수 있는 충분한 시간이 있는 약 30분 후에 아메바 모양으로 돌아갑니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Eppendorf 미세 원심분리기 5424/5424R	열과학	05-400-002
Eppendorf 5702R 원심분리기(A-4-38 모델 로터 포함)	열과학	12823252
안전 캐비닛 Foruna - SCANLAF	라보진
바이오 포토미터 플러스	에펜도르프
CLSM 710	자이스
정제 한천	옥소이드	LP0028
SM 국물	중간	SMB0102
2x LB 국물	중간	LBD0102
HEPES 유리산	시그마 알드리치/머크	391340 EMD
KH₂PO₄	VWR	피/4800/53
Na₂HPO₄ 2H₂O	VWR	10028-24-7
MgCl₂ 6H₂O	시그마 알드리치/머크	5982 EMD
CaCl₂ 2H₂O	시그마 알드리치	442909
엽산	시그마 알드리치	F7876
코	VWR	26668.263
100 x 20 mm 스타일 조직 배양 접시, 조직 배양 처리	코닝 주식회사	353003
2mm 갭 전기천공 큐벳, 긴 전극	제네플로우 리미티드	E6-0062
10 μl 접종 루프, 파란색 10 마이크로 L	열과학	129399
살포기, L자형, 멸균	그라이너 바이오 원	730190