단일 세포 박테리아 상호 작용의 시각화

초록

출처: Yarringto, K. D., et al. 단일 세포 종간 박테리아 상호 작용의 동역학적 시각화. J. Vis. 경험. (2020년)

이 비디오는 살아있는 세포 이미징을 위해 아가로스 패드 아래에서 운동성 및 비운동성 박테리아를 사용하여 공동 배양 시스템을 준비하는 방법을 보여줍니다. 운동성 박테리아가 어떻게 화학적 유인제를 감지하고 비운동성 콜로니에 침입하여 박테리아 상호 작용을 드러내는지 보여줍니다.

프로토콜

1. 박테리아 세포 및 접종 패드의 준비

1. 각 계대 배양의 광학 밀도(OD₆₀₀)를 측정하고 녹 농균 을 OD₆₀₀ = 0.03으로, 황 색포도상구 균을 OD₆₀₀ = 0.10으로 희석하여 37°C로 예열된 M8T(최소 배지 8 + 트립톤)에서 희석합니다. 녹 농균 과 황색포도상구 균을 1:1 비율로 혼합하고 소용돌이를 돌립니다.
   메모: 균주에 항생제가 필요한 경우 하룻밤 및 계대 배양에 추가할 수 있지만 공동 배양의 다른 종에 영향을 미치는 경우 이미징을 위해 종을 혼합할 때 추가해서는 안 됩니다. 플라스미드 안정성과 공동 배양의 모든 종에 대한 항생제의 효과는 사용되는 각 유기체/플라스미드에 대해 결정되어야 합니다.
2. 미리 예열된 멸균 35mm 유리 커버슬립 접시의 바닥에 1μL의 공배양을 고르게 피펫팅합니다.
3. 멸균 핀셋을 사용하여 금형에서 실리콘 컷아웃을 제거합니다.
4. 멸균 주걱을 사용하여 접시에서 패드를 제거합니다.
   1. 금형을 거꾸로 잡고 약간 구부러진 주걱을 패드 가장자리 아래로 밀어 넣어 멸균 페트리 플레이트 뚜껑 위에 떨어뜨립니다.
      메모: 패드를 무리하게 빼지 않으면 찢어질 수 있습니다. 패드의 어느 쪽이 바닥인지 추적하십시오.
5. 패드 아래에 90° 각도의 주걱을 밀어 접종된 커버슬립 위에 놓아 패드를 박테리아 세포가 있는 접시에 아래면이 아래로 향하게 옮깁니다. 90° 각도의 주걱을 사용하여 패드를 커버슬립과 같은 높이로 만들고 기포를 부드럽게 밀어냅니다.
6. 젖은 물티슈에서 과도한 수분을 제거하고 접시 가장자리 주위에 놓고 패드에 닿지 않도록 합니다. 이제 샘플을 이미징할 준비가 되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스 패드
35mm 유리 바닥 접시, 20mm 마이크로웰, 1.5 커버 유리	셀비스	D35-20-1.5-N	하나는 아가로스 패드 몰드용, 하나는 실험용
라운드 테이퍼 주걱	VWR	82027-530
실리콘 아이솔레이터, 프레스 투 씰, 1웰, 직경 2.0mm, 20mm, 실리콘/접착제	시그마-알드리치	S6685-25개	아가로스 패드 몰드용
핀셋	VWR	89259-944
M8T 미니멀 미디어
D(+) 포도당	RPI	지32045
KH₂PO₄	RPI	P250500
MgSO₄	시그마-알드리치	208094
나크롬	RPI	에스23025
Na₂HPO₄·7H₂O	시그마-알드리치	230391
트립톤	BD 바이오사이언스	DF0123173
박테리아 균주
녹농균 PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP)	PMID: 9361441
황색포도상구 균 USA300 LAC(WT)	PMID: 23404398		USA300 CA-메티실린 내성 균주 LAC 플라스미드가 없는