비이온성 세제 상 분리를 사용한 박테리아 지단백질 농축

초록

출처: Armbruster, KM, Meredith, TC 질량 분석법에 의한 구조 결정을 위한 박테리아 지단백질의 농축 및 N-말단 리포펩티드의 제조. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 온열 시 상 분리를 거치는 비이온성 세제를 사용하여 박테리아 지단백질을 농축하는 방법을 보여줍니다. 순차적인 온도 변화와 원심분리 단계를 통해 지단백질은 세제 상으로 선택적으로 분할되는 반면 비지단백질 오염 물질은 제거됩니다. 그런 다음 농축된 지단백질을 침전, 세척 및 다운스트림 응용 분야를 위해 재현탁됩니다.

프로토콜

1. Triton X-114 (TX-114) 상 분배에 의한 지단백질 농축

1. 박테리아 용해물을 TX-114 계면활성제로 TX-114 계면활성제를 얼음처럼 차가운 트리스 완충 식염수/에틸렌디아민테트라아세트산(TBSE)에 동일한 부피의 4%(vol/vol)를 첨가하여 최종 농도 2%(vol/vol)로 보충하고 얼음 위에서 1시간 동안 배양하고 ~15분마다 반전하여 혼합합니다.
   메모: 냉각하면 상층액과 계면활성제가 섞일 수 있습니다.
2. 튜브를 37°C 수조로 옮기고 10분 동안 배양하여 상 분리를 유도합니다. 시료를 실온에서 10분 동안 10,000 x g로 원심분리하여 2상 분리를 유지합니다.
3. 상부 수성상을 부드럽게 피펫팅하여 버립니다. 얼음처럼 차가운 TBSE를 하부 계면활성제 상에 첨가하여 튜브를 원래 부피로 채우고 반전시켜 혼합합니다. 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
4. 튜브를 37°C 수조로 옮기고 10분 동안 배양하여 상 분리를 유도한 다음 실온에서 10분 동안 10,000 x g으로 원심분리합니다.
5. 1.3-1.4단계를 한 번 더 반복하여 총 3번의 분리를 수행합니다. 상부 수성상을 제거하고 폐기하십시오.
6. 계면활성제 상에 얼음처럼 차가운 TBSE 1부피를 첨가하여 추출 과정에서 형성된 침전된 단백질의 펠릿(튜브 바닥에서 볼 수 있음)을 제거합니다. 4°C에서 16,000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 불용성 단백질을 펠릿화합니다.
   메모: 샘플은 단상으로 유지되어야 합니다. 상 분리가 발생하면 샘플을 다시 냉각하고 다시 원심분리합니다. 펠릿은 일반적으로 비지단백 오염 물질로 구성되지만 추가 분석을 위해 보관할 수 있습니다.
7. 즉시 상청액을 1250μL의 100% 아세톤이 들어 있는 신선한 2.0mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 점성이 있으므로 팁에서 샘플을 완전히 세척하기 위해 위아래로 완전히 피펫팅합니다. 반전으로 혼합하고 -20°C에서 밤새 배양하여 단백질을 침전시킵니다.
8. 샘플을 실온에서 20분 동안 16,000 x g으로 원심분리하여 튜브의 방향에 주의하면서 지단백질을 펠릿화합니다. 지단백질은 튜브의 외벽을 따라 얇고 흰색 필름을 형성합니다.
9. 펠릿을 100% 아세톤으로 두 번 세척합니다. 아세톤을 디캔팅하고 샘플을 자연 건조시킵니다.
10. 20-40 μL의 10 mM Tris-hydrochloride, pH 8.0 또는 표준 Laemmli SDS-PAGE 샘플 완충액을 첨가하고 침전된 지단백질과 함께 벽에 대해 위아래로 피펫팅하여 완전히 재현탁합니다. 피펫 팁으로 튜브 측면을 긁어 지단백질을 제거합니다.
    메모: 지단백질은 Tris 완충액에 용해되지 않고 오히려 현탁액을 형성합니다.
    1. 지단백질은 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세톤	EMD	AX0116-6
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	피셔 사이언티픽	BP118 시리즈
트리스-염산염(HCl)	피셔 사이언티픽	BP152
트리톤 X-114	시그마-알드리치	93422
소금	마크롱 정밀 화학	7581-06