$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Triton X-114 (TX-114) 상 분배에 의한 지단백질 농축
- 박테리아 용해물을 TX-114 계면활성제로 TX-114 계면활성제를 얼음처럼 차가운 트리스 완충 식염수/에틸렌디아민테트라아세트산(TBSE)에 동일한 부피의 4%(vol/vol)를 첨가하여 최종 농도 2%(vol/vol)로 보충하고 얼음 위에서 1시간 동안 배양하고 ~15분마다 반전하여 혼합합니다.
메모: 냉각하면 상층액과 계면활성제가 섞일 수 있습니다. - 튜브를 37°C 수조로 옮기고 10분 동안 배양하여 상 분리를 유도합니다. 시료를 실온에서 10분 동안 10,000 x g로 원심분리하여 2상 분리를 유지합니다.
- 상부 수성상을 부드럽게 피펫팅하여 버립니다. 얼음처럼 차가운 TBSE를 하부 계면활성제 상에 첨가하여 튜브를 원래 부피로 채우고 반전시켜 혼합합니다. 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
- 튜브를 37°C 수조로 옮기고 10분 동안 배양하여 상 분리를 유도한 다음 실온에서 10분 동안 10,000 x g으로 원심분리합니다.
- 1.3-1.4단계를 한 번 더 반복하여 총 3번의 분리를 수행합니다. 상부 수성상을 제거하고 폐기하십시오.
- 계면활성제 상에 얼음처럼 차가운 TBSE 1부피를 첨가하여 추출 과정에서 형성된 침전된 단백질의 펠릿(튜브 바닥에서 볼 수 있음)을 제거합니다. 4°C에서 16,000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 불용성 단백질을 펠릿화합니다.
메모: 샘플은 단상으로 유지되어야 합니다. 상 분리가 발생하면 샘플을 다시 냉각하고 다시 원심분리합니다. 펠릿은 일반적으로 비지단백 오염 물질로 구성되지만 추가 분석을 위해 보관할 수 있습니다. - 즉시 상청액을 1250μL의 100% 아세톤이 들어 있는 신선한 2.0mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 점성이 있으므로 팁에서 샘플을 완전히 세척하기 위해 위아래로 완전히 피펫팅합니다. 반전으로 혼합하고 -20°C에서 밤새 배양하여 단백질을 침전시킵니다.
- 샘플을 실온에서 20분 동안 16,000 x g으로 원심분리하여 튜브의 방향에 주의하면서 지단백질을 펠릿화합니다. 지단백질은 튜브의 외벽을 따라 얇고 흰색 필름을 형성합니다.
- 펠릿을 100% 아세톤으로 두 번 세척합니다. 아세톤을 디캔팅하고 샘플을 자연 건조시킵니다.
- 20-40 μL의 10 mM Tris-hydrochloride, pH 8.0 또는 표준 Laemmli SDS-PAGE 샘플 완충액을 첨가하고 침전된 지단백질과 함께 벽에 대해 위아래로 피펫팅하여 완전히 재현탁합니다. 피펫 팁으로 튜브 측면을 긁어 지단백질을 제거합니다.
메모: 지단백질은 Tris 완충액에 용해되지 않고 오히려 현탁액을 형성합니다.- 지단백질은 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.