인간 노로바이러스의 박테리아 유래 재조합 P 도메인 단백질의 정제

초록

출처: Leuthold, M. M., et al. X선 결정학을 위한 대 장균 에서 인간 노로바이러스 돌출 도메인 생산. J. Vis. 경험. (2016).

이 비디오는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 재조합 인간 노로바이러스 P 도메인을 정제하는 방법을 보여주며, 차등 기공 접근성을 기반으로 고분자량 및 저분자량 불순물로부터 표적 단백질을 분리하는 방법을 강조합니다. 이 공정은 UV 흡광도로 모니터링되고 용출된 분획의 SDS-PAGE 분석을 통해 확인됩니다.

프로토콜

1. 3차 정화 단계

1. HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 정제 시스템의 펌프와 파이프를 세척하고 SEC(크기 배제 크로마토그래피) 컬럼(재료 목록 참조)을 GFB(겔 여과 완충액)로 사전 평형화합니다.
2. 농축된 샘플의 부피에 따라 슈퍼루프(최대 12ml) 또는 루프(최대 3ml)를 사용하여 1ml/min의 유속으로 P 도메인을 컬럼에 주입합니다. 주입이 끝나면 유속을 2.5ml/min으로 높입니다.
3. OD(광학 밀도)가 증가하고 P 도메인이 컬럼에서 빠지면 1.5ml의 분획을 수집합니다. 12% 겔과 함께 SDS-PAGE를 사용하여 분획을 확인합니다(그림 1A 및 1B). 가장 순수한 분획만 모으고 ~ 3 mg/ml 및 ~ 8 mg/ml로 농축하십시오.
   참고: ~110ml(공극 부피) 후 대부분의 불순물은 320ml 베드 부피의 SEC 컬럼에서 용출됩니다. P 도메인은 일반적으로 이량체로 용출됩니다. P 도메인 이량체의 용출 시간/부피는 SEC 컬럼의 준비 등급(pg)에 따라 다릅니다.

결과

그림 1. 3차 정제 단계에 대한 개략적이고 대표적인 결과.
SEC를 사용한 P 도메인 용출의 크로마토그램 및 해당 SDS-PAGE 결과. 검은색 숫자는 수집되는 분수를 나타냅니다. A) SEC 컬럼의 분리 개략도(SEC 비드는 회색 구체로 표시됨). 12% SDS-PAGE는 SEC 용출 중에 수집된 분획에 존재하는 단백질을 보여주며, 이후에 풀링되어 X선 결정학에 사용됩니다. ...

재료