음의 이온 교환 크로마토그래피에 의한 박테리아 단백질의 선택적 정제

초록

출처: Kuo, T., et al. 배치 모드에서 대장균에서 과발현된 헬리코박터 파일로리 호중구 활성화 단백질의 1단계 음성 크로마토그래피 정제. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 박테리아 용해물에서 독성 관련 단백질을 정제하는 음성 크로마토그래피 기술을 보여줍니다. 완충 용액에 양전하를 띤 수지를 사용함으로써 숙주 세포 단백질은 선택적으로 유지되는 반면, 중성에 가까운 표적 단백질은 결합되지 않은 상태로 유지되어 플로우 스루에 수집됩니다. 이 방법을 사용하면 다운스트림 응용 분야를 위한 표적 단백질을 효율적으로 분리하고 회수할 수 있습니다.

프로토콜

1. 대장 균(E. coli)에서 재조합 HP-NAP의 발현

1. 앞서 설명한 바와 같이 H. pylori 26695 균주로부터 헬리코박터 파일로리 호중구 활성화 단백질(HP-NAP)의 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 pET42a-NAP를 준비합니다. 원하는 점 돌연변이가 있는 HP-NAP의 DNA 서열을 포함하는 플라스미드를 준비합니다.
2. 42°C에서 45초 동안 열 충격에 의해 상기 DNA 플라스미드 10ng를 대 장균 BL21(DE3) 유능 세포로 형질전환하고, 50μg/ml 카나마이신을 함유한 용원성 국물(LB) 한천 플레이트에 세포를 줄무늬로 만들고 플레이트를 37°C에서 16시간 동안 배양합니다.
3. 50μg/ml 카나마이신과 함께 5ml의 LB 국물이 들어 있는 개별 튜브에 단일 콜로니를 접종하고 170rpm에서 흔들면서 37°C에서 16시간 동안 전배양으로 성장시킵니다.
4. 1L 플라스크에 50μg/ml의 카나마이신을 함유한 LB 국물 200ml에 상기 전배양 세포 2ml를 접종한다. 접종된 배양 플라스크를 37°C에서 2시간 동안 170rpm에서 흔들면서 600nm에서의 흡광도가 자외선-가시광선(UV/VIS) 분광 광도계에 의해 검출된 약 0.4-0.5에 도달할 때까지 배양합니다.
5. 80μl의 1M 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 위 배양액에 첨가하여 최종 농도 0.4mM으로 하여 HP-NAP의 발현을 유도합니다. 600nm에서의 흡광도가 약 1.6-1.7에 도달할 때까지 배양액을 3시간 동안 배양합니다.
6. 세포를 4°C에서 6,000 x g으로 15분 동안 원심분리하여 상청액을 제거합니다. 정제될 때까지 세포 펠릿을 -70°C에서 보관합니다.

2. HP-NAP를 함유하는 수용성 단백질 분획물의 제조

메모: 다음 단계는 모두 4°C에서 수행됩니다.

1. 프로토콜 단계 1.6에서 제조된 세포 펠릿 50ml를 0.13mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 0.03mM N-알파-토실-L-리시닐-클로로메틸케톤(TLCK) 및 0.03mM N-토실-L-페닐알라니닐-클로로메틸케톤(TPCK)을 함유하는 20mM 트리스-HCl, pH 9.0, 50mM NaCl 20ml에 재현탁합니다.
2. 박테리아 현탁액을 15,000 내지 20,000psi 범위에서 작동되는 고압 균질화기를 통해 4°C에서 7회 통과시켜 박테리아 세포를 파괴합니다.
3. 초원심분리기를 사용하여 4°C에서 30,000 × g의 세포 용해물을 1시간 동안 원심분리하여 가용성 및 불용성 단백질 분획을 분리합니다. 상청액을 가용성 단백질 분획으로 비커로 옮깁니다.
4. 제조업체의 지침에 따라 소 혈청 알부민(BSA)을 표준으로 하는 상용 키트를 사용하여 Bradford 방법으로 가용성 단백질 분획의 단백질 농도를 측정합니다.
5. 프로토콜 단계 2.3에서 얻은 수용성 단백질 분획 20ml에 177.6μl의 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 9.0에서 pH 8.0으로 조정합니다.
6. 위의 단백질 용액에 20mM Tris-HCl, pH 8.0, 50mM NaCl을 첨가하여 최종 단백질 농도를 0.5mg/ml로 만듭니다.

3. DEAE 이온 교환 수지를 사용한 네거티브 모드 배치 크로마토그래피에 의한 대장균에서 재조합 HP-NAP의 정제

1. 디에틸아미노에틸(DEAE) 수지 15ml를 준비합니다.
   1. DEAE 수지 건조 분말 0.6g의 무게를 측정하고 실온에서 최소 1일 동안 20mM Tris-HCl, pH 8.0, 50mM NaCl 30ml에 현탁합니다.
   2. 수지를 4°C에서 10,000 x g으로 1분 동안 원심분리합니다.
   3. 상청액을 제거하고 버립니다.
   4. 20mM Tris-HCl, pH 8.0, 50mM NaCl 15ml를 첨가합니다.
   5. 프로토콜 단계 3.1.2에서 3.1.4를 네 번 더 반복합니다.
   6. 15ml의 침전된 수지(30ml Tris 완충액에 50% 슬러리)를 4°C에서 보관하여 후속 사용을 위해 보관합니다.
      메모: 다음 단계는 모두 4°C에서 수행됩니다.
2. 프로토콜 단계 2.6에서 제조한 수용성 단백질 45ml를 수지 15ml에 첨가하고, 단백질/수지 슬러리를 마그네틱 교반기로 4°C에서 1시간 동안 교반한다.
3. 단백질/수지 슬러리를 마개가 장착된 플라스틱 또는 유리 기둥에 붓습니다. 수지가 중력에 의해 가라앉도록 합니다.
4. 스톱콕을 열어 컬럼의 액체 레벨이 레진 바로 위에 올 때까지 단백질 용액이 중력 흐름에 의해 컬럼을 통과하도록 합니다. 정제된 HP-NAP를 포함하는 결합되지 않은 분획으로 플로우스루를 수집합니다.
5. 얼음처럼 차가운 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl 15 ml를 컬럼에 첨가합니다.
6. 마개를 열어 컬럼의 액체 레벨이 레진 바로 위에 올 때까지 세척 완충액이 중력 흐름에 의해 컬럼을 통과하도록 합니다. 유동을 세척 분율로 수집합니다.
7. 프로토콜 단계 3.5에서 3.6을 4회 더 반복하여 추가 세척 분획을 수집합니다.

재료