Streptococcus mutans에서 폴리히스티딘 태그 단백질을 정제하는 절차

초록

출처: Murata, T., et al. Streptococcus mutans에서 고분자량 단백질의 정제. J. Vis. Exp. (2019)

이 비디오는 Streptococcus mutans에서 분비되는 폴리히스티딘 태그 단백질의 정제를 위한 단계별 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 황산암모늄 침전에 의해 배양 상청액에서 단백질을 농축합니다.
   메모: 표적 단백질이 세포 내인 경우 세포체에서 추출합니다.
   1. 박테리아 배양액(Streptococcus mutans) 현탁액을 4°C에서 10,000 x g 에서 20분 동안 원심분리합니다. 배양 상청액을 3L 유리 비커에 회수합니다.
   2. 1,122g의 황산암모늄을 2L의 상청액(80% 포화도)에 첨가하여 마그네틱 교반기를 사용하여 세게 교반합니다. 교반하면서 4°C에서 4시간 이상 침전물이 형성되도록 합니다.
      메모: 침전물 형성은 밤새 계속될 수 있습니다.
   3. 황산암모늄 침전 용액을 4°C에서 20분 동안 15,000 x g 으로 원심분리합니다. 상청액을 디캔팅합니다.
   4. 주걱으로 침전물을 모아 200mL 유리 비커에 옮깁니다. 펠릿을 35mL의 결합 완충액(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 5mM 이미다졸, pH 8.0)에 재현탁합니다.
   5. 4°C에서 재생된 셀룰로오스 투석 튜브를 사용하여 2,500mL의 결합 완충액에 대해 현탁액을 교반하면서 투석합니다. 2시간 후에 투석액을 교체하고 밤새 투석을 계속합니다.
   6. 투석액을 다시 교체하십시오. 추가 2시간 동안 투석을 계속합니다.
2. 투석된 현탁액을 4°C에서 10분 동안 20,000 x g 으로 원심분리합니다. 흡입 여과 장비를 사용하여 멤브레인 필터를 통해 상청액을 여과합니다. 여과액을 75cm² 플라스크로 옮깁니다.
3. 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 여과된 현탁액에서 폴리히스티딘 태그가 있는 글루코실트랜스퍼라제-SI(GTF-SI)를 분획합니다.
   1. Ni 하전 IMAC 수지 슬러리 2mL(약 1mL의 수지)를 실리콘 튜브에 출구가 장착된 크로마토그래피 컬럼으로 옮깁니다. 중력 흐름에 의해 저장 용액을 제거합니다.
      주의: IMAC 전체에서 수지가 마르지 않도록 하십시오.
   2. 컬럼에 증류수 3mL를 첨가하여 수지를 세척합니다. 수지를 평형화하기 위해 결합 완충액 5mL를 첨가합니다.
   3. 호프만 꼬집기 수탉으로 흐름을 차단하십시오. 2단계에서 여과된 현탁액 5mL를 첨가하여 슬러리를 만듭니다.
   4. 나머지 여과된 현탁액에 모든 슬러리를 추가합니다. 혼합물을 4°C에서 30분 동안 부드럽게 휘젓습니다.
   5. 혼합물을 컬럼에 다시 로드합니다. 중력 흐름에 의해 서스펜션을 제거합니다. IMAC 수지를 20mL의 결합 완충액으로 세척합니다.
      메모: 후속 IMAC 전체에서 호프만 핀치 콕을 사용하여 유속을 약 2mL/min으로 조정합니다.
   6. 재조합 GTF-SI를 20mL의 용출 완충액(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 500mM 이미다졸, pH 8.0)으로 용리합니다.
      메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 용출액은 4°C에서 보관해야 합니다. IMAC 수지는 재사용할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
원심 한외여과 장치	사토리우스	VS2032	완충액 대체 및 단백질 농축
원심 분리기	쿠보타	7780II
크로마토그래피 컬럼	바이오 래드	7321010	IMAC용
투석막 클램프	피셔 브랜드	21-153-100
투석 튜브	하나로	2-316-06
이미다졸	와코	095-00015	결합 완충액 및 용출 완충액 준비
부 화기	Nippon Medical & Chemical Instruments (일본 의료 및 화학 기기)	LH-100-RDS	온도 설정: 37 °C
마이크로 원심분리기	쿠보타	3740
염화나딤	와코	191-01665	결합 완충액 및 용출 완충액의 제조
인산이수소나트륨 이수화물	와코	192-02815	결합 완충액 및 용출 완충액의 제조
수산화나트륨	와코	198-13765	결합 완충액 및 용출 완충액의 제조
황산암모늄	와코	015-06737	황산암모늄 침전
Ni 충전 수지	바이오 래드	1560133	IMAC용
멤브레인 필터	머크 밀리포어	JGWP04700	직경 0.2μm