급속 평형 투석법을 통한 결핵 병변으로부터 카제움에 대한 약물 결합 측정

초록

출처: Sarathy, JP et al. 결핵 병변에서 약물 침투를 예측하는 시험관 내 카제움 결합 분석. J. Vis. 경험. (2017년)

이 비디오는 급속 평형 투석을 사용하여 결핵 병변에서 카세움에 대한 약물 결합을 측정하기 위한 시험관 내 분석을 보여줍니다. 카세움 현탁액을 준비하고, 투석을 수행하고, 카세움으로의 약물 침투를 예측하기 위해 결합되지 않은 약물 분획을 계산하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. 급속 평형 투석(RED) 분석

1. 테스트 화합물의 500μM 용액 6.5μL를 643.5μL의 균질산염에 스파이크하여 5μM(≤1% DMSO)의 최종 농도와 와류를 달성합니다.
2. RED 인서트를 베이스 플레이트에 놓습니다. 각 RED 인서트의 기증자 챔버(빨간색 링)에 200μL의 약물 스파이크 매트릭스를 추가하고 각 리시버 챔버에 350μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가합니다. 각 테스트 화합물에 대해 3개의 삽입물을 준비합니다(샘플 3개). 접착 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉하고 열혼합기에서 200rpm(1 x g)의 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.
3. 배양 후, 위아래로 2-3회 피펫팅하여 기증자와 수신기 챔버의 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 기증자 챔버에서 균질액 20μL 분취량을 피펫팅하고 1.5mL 튜브(1:1)에 20μL의 깨끗한 PBS에 첨가합니다. 유사하게, 리시버 챔버에서 PBS 샘플의 20μL 분취량을 피펫팅하고 20μL의 깨끗한 균질염에 첨가합니다(매트릭스 매칭).
   메모: 매트릭스 매칭을 사용하면 정량 분석을 위해 2개의 개별 검량선(균질염 및 PBS)을 만들 필요가 없습니다. 기증실의 내용물은 시간이 지남에 따라 침전될 수 있습니다. 분취량을 제거하기 전에 피펫팅하여 내용물을 부드럽게 혼합하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Pierce RED 장치 재사용 가능한 베이스 플레이트	피셔 사이언티픽	파이-89811
피어스 RED 장치 인서트, 50/상자	피셔 사이언티픽	파이-89809
RED 인서트 제거 도구 피어싱	피셔 사이언티픽	89812
접착 플레이트 씰	피셔 사이언티픽	08-408-240
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)	라이프 테크놀로지	10010-049
DMSO	시그마	472301