박테리아의 항생제 지속성을 연구하기 위한 미세유체 타임랩스 현미경

초록

출처: Oms, T., et al. 대 장균에서 항생제 지속성의 집단 및 단일 세포 분석. J. Vis. 경험. (2023년)

이 비디오는 미세유체 시스템 내에서 형광 표지된 DNA 결합 단백질을 발현하는 개별 박테리아 세포를 모니터링하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이는 항생제가 대부분의 세포를 억제하는 반면, 지속성 세포의 하위 집단은 치료 중에 살아남고 항생제 제거 후 다시 자라는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

미세유체 타임랩스 현미경 이미징

메모: 다음 섹션에서는 미세유체 플레이트의 준비와 타임랩스 이미지 획득 및 이미지 분석 절차에 대해 설명합니다. 본 실험의 목적은 항생제 치료 시 지속성 표현형을 단세포 수준에서 관찰하고 분석하는 것이다. 이 실험 중에 수집된 데이터는 해결된 질문 및/또는 실험 중에 사용된 형광 리포터에 따라 광범위한 결과를 생성하는 데 사용될 수 있습니다. 여기서의 실험에서는, 지속성 세포와 비지속성 세포에서의 핵형 조직을 반영하는 세포 길이와 HU-mCherry 형광의 정량 분석을 수행하였다.

1. 미세유체 타임랩스 현미경을 위한 박테리아 세포 배양
   1. 유리관(≥25mL)에 분리된 콜로니와 함께 배지(3-[N-모르폴리노] 프로판술폰산(MOPS) 글리세롤 0.4%, 필요한 경우 선택적 항생제 보충) 5mL를 접종하고, 밤새 37°C 및 180rpm으로 설정된 진탕 인큐베이터에 튜브를 넣습니다(15시간에서 19시간 사이).
   2. 다음날, OD₆₀₀ nm를 측정하고 유리관의 신선한 온도 조절 배지(37°C, MOPS 글리세롤 0.4%)에서 배양액을 최종 OD₆₀₀ nm ~0.001로 희석합니다. 배양물을 37°C 및 180rpm의 진탕 인큐베이터에서 밤새 (15시간에서 19시간 사이) 성장시켜 다음날 초기 지수상 배양을 얻습니다.
2. 미세유체 플레이트 및 타임랩스 현미경 이미징의 준비
   메모: 미세유체 실험은 상업적으로 이용 가능한 미세유체 장치(여기에 설명된 대로) 또는 사내에서 생산된 미세유체 시스템에서 수행할 수 있습니다.
   1. 미세유체 플레이트의 모든 웰에서 보존 용액(있는 경우)을 제거하고 신선한 배양 배지로 교체합니다.
      메모: 미세유체 플레이트에 폐기물 배출구가 있는 경우 배출구 웰의 보존 용액을 제거해야 하지만 매체로 교체해서는 안 됩니다.
   2. 밀봉 버튼을 클릭하거나 미세유체 소프트웨어를 통해 매니폴드 시스템으로 미세유체 플레이트를 밀봉합니다(먼저 도구 선택, 밀봉 플레이트 선택).
      메모: 플레이트를 밀봉하려면 매니폴드에 대해 플레이트를 수동으로 압착하여 플레이트와 매니폴드에 균일한 압력을 가해야 합니다. 올바르게 수행되면 ONIX2 인터페이스에 "봉인된" 메모가 나타나야 합니다. 매니폴드가 파손될 수 있는 잠재적인 위험을 피하기 위해 유리 슬라이드에 압력을 가하지 않는 것이 중요합니다.
   3. 밀봉되면 첫 번째 프라이밍 시퀀스를 수행합니다(미세유체 소프트웨어 인터페이스에서 액체 프라이밍 시퀀스 실행 클릭).
      참고: Run Liquid Priming Sequence 는 웰 1-5의 경우 6.9kPa에서 5분의 관류에 해당하고, 웰 8의 경우 6.9kPa에서 5분의 관류, 6.9kPa에서 5분 동안 웰 6에 대한 최종 관류 라운드에 해당합니다. Run Liquid Priming Sequence 를 사용하면 서로 다른 웰을 연결하는 채널에 여전히 존재할 수 있는 보존 용액을 제거할 수 있습니다.
   4. 현미경 이미징이 시작되기 최소 2시간 동안 원하는 온도(여기서는 37°C)에서 현미경의 온도 조절 캐비닛에서 플레이트를 배양합니다.
   5. 실험을 시작하기 전에 두 번째 Run Liquid Priming Sequence를 시작합니다.
   6. 미세유체 소프트웨어 인터페이스에서 밀봉을 클릭하여 미세유체 플레이트를 밀봉합니다. 웰 1 및 웰 2의 배지를 200 μL의 신선한 배지로, 웰 3의 배지를 항생제를 함유하는 200 μL의 신선한 배지(여기서는 5 μg·^mL-1의 오프록사신(OFX))로, 웰 4 및 웰 5의 배지를 200 μL의 신선한 배지로, 웰 6에서 200 μL의 신선한 배지로 교체하고, 및 신선한 배지에서 OD₆₀₀ nm 0.01로 희석된 200 μL의 배양 샘플(단계 1.2에서)이 있는 웰 8에서.
   7. 2.2단계에서 설명한 대로 미세유체 플레이트를 밀봉하고 현미경 캐비닛 내부의 현미경 대물렌즈에 놓습니다.
      메모: 미세유체 플레이트를 배치하기 전에 현미경 대물렌즈에 침지 오일 한 방울을 놓으십시오.
   8. 미세유체 소프트웨어에서 세포 로딩 을 클릭하여 세포가 미세유체 플레이트에 로딩되도록 합니다.
      메모: 세포 로딩 단계는 웰 8에 대해 13.8kPa에서 15초의 관류, 웰 6 및 웰 8에 대해 27.6kPa에서 15초의 관류, 6.9kPa에서 30초 동안 웰 6에 대한 최종 관류 라운드로 구성됩니다. 미세유체 플레이트의 세포 밀도는 실험에 매우 중요합니다. 이 미세유체 프로토콜의 첫 번째 부분은 항생제 치료 전에 신선한 배지에서 6시간 동안 박테리아를 성장시키는 것으로 구성됩니다. 6시간의 성장 후, 세포 밀도는 희귀한 지속성 세포를 검출하기에 충분해야 합니다(이 연구에 사용된 조건에서 지속성 세포는 ^10-4의 빈도로 생성됨). 세포 밀도가 너무 높으면 개별 세포를 구별하기 어려워 정밀한 단일 세포 분석이 불가능합니다. 성장 속도는 배지에 직접적으로 의존하므로 실험을 시작하기 전에 현미경 필드의 세포 밀도를 평가해야 합니다.
   9. 투과광 모드를 사용하여 최적의 초점을 설정하고 적절한 셀 수가 관찰되는 여러 관심 영역(ROI)을 선택합니다(필드당 최대 300개 셀).
      메모: 희귀 지속성 세포가 이미지화되도록 최소 40개의 ROI를 선택합니다.
   10. 미세유체 소프트웨어에서 프로토콜 만들기를 클릭합니다. 6.9 kPa에서 6 시간 동안 신선한 배지를 주입한 후(웰 1-2), 6.9 kPa에서 항생제를 함유하는 배지를 6시간 동안 주입하고(웰 3), 마지막으로 20시간 동안 6.9 kPa에서 신선한 배지를 주입합니다(웰 4-5).
       메모: 0.01의 OD_600nm 로 희석된 박테리아 배양은 박테리아가 미세유체 챔버에서 6시간 동안 성장할 수 있도록 하여 세포가 기하급수적인 성장 단계에 있음을 보장합니다. 로딩 단계(2.8단계 참조) 동안 미세유체 장치에 도입된 세포의 수에 따라 성장 단계의 지속 시간을 조정하여 ROI당 최대 300개의 세포를 얻을 수 있습니다. 지속성은 드문 현상이므로 ROI당 세포 수를 늘리면 지속성 세포를 관찰할 가능성이 높아집니다. 그러나 셀 수는 ROI당 300셀을 초과해서는 안 되며, 이는 단일 셀 분석을 지루하게 만듭니다.
   11. 투과광과 형광 리포터용 여기 광원을 사용하여 15분마다 한 프레임씩 타임랩스 모드에서 현미경 이미징을 수행합니다. 여기에서는 mCherry 신호에 대한 560nm 여기 광원이 사용되었습니다(필터 00[530-585 ex, 615LP em, Zeiss] 및 mCherry의 경우 100ms 노출이 있는 10% 전력에서 580nm LED). 세포 이미징에는 Zeiss 호환 Zen3.2 소프트웨어가 사용되었습니다.
3. 이미지 분석
   메모: 현미경 이미지의 열기 및 시각화는 오픈 소스 ImageJ/Fiji 소프트웨어(https://fiji.sc/)를 사용하여 수행됩니다. 정량적 이미지 분석은 오픈 소스 ImageJ/Fiji 소프트웨어와 무료 MicrobeJ 플러그인(https://microbej.com)을 사용하여 수행됩니다. 이 프로토콜에서는 MicrobeJ 5.13I(14) 버전이 사용되었습니다.
   1. 컴퓨터에서 ImageJ/Fiji 소프트웨어를 열고 하이퍼스택 타임랩스 현미경 이미지를 Fiji 로딩 표시줄로 드래그합니다. 이미지 > 색상 > 합성 만들기 를 사용하여 하이퍼스택의 여러 채널을 융합합니다. 타임랩스 실험의 채널이 원하는 색상과 일치하지 않는 경우(예: 위상차가 회색 대신 빨간색으로 표시됨) 이미지 > 색상 > 채널 정렬 을 사용하여 채널에 적절한 색상을 적용합니다.
   2. MicrobeJ 플러그인을 열고 수동 편집 인터페이스를 사용하여 박테리아 세포를 검출합니다. 자동으로 감지된 셀을 삭제하고 관심 있는 지속성 셀을 프레임별로 수동으로 윤곽을 그립니다.
      메모: 다양한 설정을 사용하여 개별 셀을 자동으로 감지할 수 있습니다. 분석된 지속성 세포가 긴 필라멘트를 형성하기 때문에 수동 검출이 사용되었으며, 이는 자동 검출을 사용하여 올바르게 검출되는 경우가 거의 없습니다.
   3. 감지 후 MicrobeJ 수동 편집 인터페이스에서 결과 아이콘을 사용하여 ResultJ 테이블을 생성합니다. ResultJ 파일을 저장하고 이를 사용하여 단일 세포 분석에서 관심 있는 다양한 매개변수에 대한 통찰력을 얻습니다. 이 프로토콜에서는 HU-mCherry 강도의 평균 형광, 세포 길이 및 개별 세포의 세포 면적을 내보냈습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
액시오 옵저버	자이스		도립 형광 현미경
피지	이미지J	https://fiji.sc/	이미지 소프트웨어; Schindelin et al. 출판물에 사용되는 경우
대장균 K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)		BE10	Wt 기준 변형률, 실험실 변형률
대장균 K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT		BE16	HU-mCherry 융합은 천연 유전자좌, 실험실 균주에서 P1 형질도입을 통해 통합됩니다.
CellASIC ONIX 미세유체 시스템	머 크	CAX2-S0000	미세유체 시스템
미세유체 플레이트 CellASIC ONIX	머 크	B04A-03-5PK	미세유체 시스템용 플레이트
셀아식 ONIX2 FG	머 크	오닉스2 1.0.1	미세유체 소프트웨어
CellASIC ONIX2 매니폴드 기본	머 크	CAX2-MBC20	매니폴드 시스템
마이크로비J	Imagej/피지 플러그인	https://www.microbej.com/	현미경 이미지 분석 플러그인. Ducret et al.for 출판물; 검출 설정: 박테리아의 경우: 면적(μm2): 0,1-max; 길이(μm): 0,5-최대; 너비(μm): 0,6-최대; 범위(μm): 0,5-최대; 각도(rad): 0-0,3; 0-max는 다른 모든 매개변수에 대해 다음과 같습니다.
Zeiss® 침지 오일 518F	자이스		현미경의 해상도를 높이는 침지 오일
젠3.2 프로	자이스		현미경 이미지 획득 및 처리 소프트웨어
오프록사신	머 크	82419-36-1	박테리아 세포를 치료하는 데 사용되는 플루오로퀴놀론 항생제
CaCl₂·2H₂O	머 크	1.02382.0250	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
CoCl₂·6H₂O	머 크	1.02539.0100	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
CuSO₄·5H₂O	머 크	1.02790.0250	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
D-(+)-포도당	시그마 알드리치	G7021-1KG	MOPS 포도당 0.4% 성장 배지의 탄소원입니다
FeSO₄·7H₂O	VWR 화학	24244.232	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
글리세롤	머 크	56815	MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지의 탄소 공급원
H₃BO₃	시그마-알드리치	B6768-1KG	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
K₂HPO₄	머 크	1.05099.1000	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
코	머 크	1.05029.1000	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
K₂SO₄	머 크	1.05153.0500	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
MgCl₂·6H₂O	머 크	1.05832.1000	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
MnCl₂·4H₂O	머 크	1.05927.0100	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
MOPS, 유리산 ULTROL® 등급	머 크	475898-500GM	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
나크롬	시그마-알드리치	에스5886-1KG	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O	머 크	1.01180.0250	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
NH₄Cl	머 크	1.01145.0500	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
N-[트리스(하이드록시메틸)-메틸]-글리신	머 크	1.08602.0250	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용
ZnSO₄·7H₂O	머 크	1.08883.0500	MOPS 포도당 0.4% 및 MOPS 글리세롤 0.4% 성장 배지용