형광 리포터 단백질을 발현하는 박테리아를 이용한 고리형 di-GMP 조절제의 스크리닝

Abstract

출처: Rugjee, K. N., et al. 녹농균에서 c-di-GMP 신호 전달을 조절하는 소분자를 스크리닝하기 위한 고처리량 설정 구축. J. Vis. 경험. (2016).

이 비디오는 c-di-GMP 민감성 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 유전자 변형 박테리아를 사용하여 순환 di-GMP 조절제의 스크리닝을 보여줍니다. 형광은 서로 다른 테스트 화합물을 포함하는 멀티웰 플레이트에서 측정됩니다. c-di-GMP 생성을 억제하는 화합물은 형광을 감소시킵니다. 그런 다음 데이터를 분석하여 박테리아에서 c-di-GMP 신호 전달의 잠재적 조절자를 식별합니다.

Protocol

1. 녹색 형광 단백질(GFP) 태그 순환 di-GMP(c-di-GMP) 리포터 녹농균 균주의 생성

1. 용원성 국물(LB) 배지 5ml에 P. aeruginosa 의 단일 콜로니를 접종하고 200rpm으로 흔들면서 37°C에서 밤새 배양합니다.
2. 하룻밤 배양액 2ml를 1L 플라스크에 담긴 신선한 LB 배지 200ml로 옮기고 200rpm으로 흔들면서 37°C에서 배양합니다.
3. 플라스크에서 1ml 샘플을 채취하고 분광 광도계를 사용하여 검사하여 30분마다 600nm(OD₆₀₀)에서 광학 밀도를 모니터링합니다.
4. OD₆₀₀ 이 0.3 - 0.5 사이에 도달하면 배양액 40ml를 50ml 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다.
5. 4°C에서 10분 동안 8,000rpm에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 상청액을 버리고, 얼음처럼 차갑고 멸균된 300mM 자당 용액 40ml에 세포를 재현탁합니다.
6. 단계 1.5에 설명된 대로 원심분리하여 세포를 두 번째로 펠릿화하고 얼음처럼 차갑고 멸균된 300mM 자당 용액 20ml에 재현탁합니다.
7. 1.5단계에서 설명한 대로 원심분리하여 세포를 마지막으로 펠릿화하고 얼음처럼 차갑고 멸균된 300mM 자당 용액 400μl에 재현탁합니다.
   참고: 이 시점의 세포 밀도는 밀리리터당 약 1 x 10¹¹ 콜로니 형성 단위(CFU/ml)여야 합니다.
8. 세포를 얼음 위에서 30분 동안 식힌 후 전기천공 준비가 됩니다.
9. 얼음 위에서 미리 냉각된 1.5ml 미세 원심분리기 튜브에서 위에서 준비된 P. aeruginosa의 전기 적극 세포 40μl에 0.2μg/μl pCdrA::gfp^C 플라스미드 용액 1μl를 첨가합니다. 현탁액을 혼합하고 미리 냉각된 2mm 전극 갭, 전기천공 큐벳으로 옮깁니다.
10. 티슈 페이퍼로 큐벳 외부의 수분을 제거하고 큐벳을 electroporator의 샘플 챔버에 넣습니다. 전압 2.5kV, 정전 용량 25μF, 저항 200 Ω의 펄스.
11. 큐벳을 제거하고 LB 배지 1ml를 추가합니다. 그런 다음 세포를 멸균 1.5ml 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 200rpm에서 흔들면서 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
12. 배양액의 10μl, 50μl 및 100μl 분취량을 암피실린(농도 100μg/ml)이 보충된 멸균 LB-한천 플레이트에 펴고 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.
13. 표준 GFP 채널이 있는 형광 현미경으로 플레이트를 검사하여 GFP 발현(485nm에서의 여기, 520nm에서의 방출)을 확인하고 단일 콜로니를 선택하여 5mL LB를 접종합니다. 단계 1.1에 설명된 대로 밤새 배양합니다. 2ml 스크류 탑 튜브에 0.5ml의 하룻밤 배양액과 0.5ml의 50% 글리세롤을 혼합하고 -80°C에서 보관합니다.

2. 접종을 위한 스타터 배양액의 준비

1. 스크리닝 2일 전, 멸균 접종 루프를 사용하여 박테리아를 플레이트 위에 부드럽게 퍼뜨려 -80°C 스톡에서 P . aeruginosa (pCdrA::gfp^C 플라스미드 포함)을 LB-한천 플레이트(100μg/ml 농도의 암피실린으로 보충)에 도금합니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.
2. 스크리닝 전날 저녁, 플레이트에서 P. aeruginosa 의 단일 콜로니를 튜브에 있는 10ml의 LB 배지(100μg/ml 농도의 암피실린으로 보충)에 접종하고 200rpm에서 흔들면서 37°C에서 밤새 사전 배양합니다.
3. 스크리닝 당일, 먼저 신선한 LB 배지로 OD₆₀₀ 1.0으로 희석한 다음 5% LB로 OD₆₀₀ 0.04(1:25 비율)로 희석하여 하룻밤 사전 배양에서 계代배양을 준비합니다.
   참고: 접종된 배지의 총 부피는 테스트할 플레이트의 수에 따라 다릅니다. 5% LB는 100% LB를 인산염 완충 식염수(PBS)로 필요한 농도로 희석하여 만듭니다. 중요한 것은 배지(5% LB)가 P. aeruginosa에서 pCdrA::gfp^C의 구성적 활성화를 허용한다는 것입니다.
4. 멸균 마그네틱 교반기 바를 용기에 추가하고 실온에서 30분 동안 마그네틱 교반기에서 최소 속도로 배양액을 교반하여 박테리아가 384웰 플레이트에 분배되기 전에 배지에 적응할 수 있도록 합니다.

3. 소분자를 함유한 384웰 플레이트의 접종 및 배양

참고: 멸균 및 우수한 무균 기술은 다음 단계에서 가장 중요합니다.

1. 양성 대조군(100% 억제)을 제조하기 위해, 2.3단계에서 준비한 계대배양의 10ml(최대 12개의 플레이트에 적합)에 20μl의 토브라마이신 설페이트(25mg/ml)를 첨가하고 부드럽게 혼합한다. 양성 대조군 배양액 40μl를 웰 A23-P23에 피펫팅합니다(그림 1).
2. 음성 대조군(0% 억제)을 준비하려면 2.3단계에서 준비한 계代배양 10ml(최대 12플레이트에 적합)에 30μl의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 음성 대조군 배양액 40μl를 웰 A24-P24에 피펫팅합니다(그림 1).
3. 소분자로 스탬핑된 각 플레이트에 대해 40μl의 희석된 하룻밤 배양물(단계 2.3에 설명됨)을 웰 A1-P22에 접종합니다(그림 1).
   참고: 이는 액체 핸들러 로봇을 사용하여 달성할 수 있습니다. 박테리아 배양의 이질적인 특성으로 인해 분배하는 동안 박테리아가 배지에 일관되게 분포되도록 지속적이고 적당한 교반을 유지하는 것이 중요합니다. 이를 위해 분배하는 동안 2.4단계의 순응된 배양액을 자기적으로 계속 교반합니다.
4. 통기성 커버 씰로 플레이트를 밀봉하고 37°C에서 6시간 동안 배양합니다.
   참고: 통기성 씰은 384개의 웰 모두에서 변하지 않는 조건을 유지하고 플레이트 전체에 걸쳐 산소 구배의 잠재적 발생을 피하는 데 중요합니다.

4. 성장(OD600) 및 세포내 c-di-GMP 수준(GFP) 측정

1. 분광 광도계 측정 약 30분 전에 결로를 방지하기 위해 플레이트 리더를 37°C로 예열합니다.
2. 읽기 전에 통기성 커버 씰을 조심스럽게 제거하십시오. 웰당 10 번의 플래시 설정과 0.2 초의 정착 시간으로 600 nm의 파장에서 광학 밀도를 측정합니다.
3. 형광을 측정하기 전에 웰 A24(음성 대조군)를 기반으로 자동 이득 및 초점 조정을 수행하고 이득 목표 값을 75%로 설정합니다(그림 1).
   1. 플레이트 리더 제어 소프트웨어에서 측정 시작을 클릭하고 '초점 및 게인 조정/플레이트 ID'' 탭을 클릭합니다.
   2. 창 오른쪽의 '초점 조정'과 '채널 A'를 선택합니다.
   3. 「게인 조정」과 「선택된 웰」을 선택하고, 「목표값」으로 「75」를 입력합니다. 마지막으로 '조정 시작'을 클릭하기 전에 플레이트 레이아웃에서 A24를 잘 선택합니다. 조정이 완료되면 '측정 시작'을 클릭합니다.
   4. 웰당 10회 플래시로 설정하고 정착 시간을 0.2초로 설정하여 485/520nm의 여기/방출 최대값에서 GFP 리포터의 형광을 측정합니다.
4. 검사한 모든 플레이트에서 데이터를 수집합니다.
   참고: 데이터 판독값은 플레이트 리더 제어 소프트웨어에 의해 기본값으로 자동으로 저장됩니다.
   1. 제어 소프트웨어 내에서 "화성" 아이콘을 클릭하여 통계 분석 패키지를 열어 판독값을 봅니다.
   2. 분석을 위해 데이터에 액세스하기 위해 관심 있는 번호판 번호를 "두 번 클릭"하여 데이터를 검색합니다.

Results

그림 1. 소분자 스크리닝 분석에 사용되는 384웰 플레이트 맵. 라이브러리의 화합물(연한 파란색)은 웰 A1-P22에 분취됩니다. 최종 농도 50μg/ml의 토브라마이신 설페이트로 구성된 "양성 대조군"(빨간색)을 웰 A23-P23에 첨가하고, 최종 농도 1% DMSO를 포함하는 "음성 대조군"(녹색)을 웰 A24-P24에 첨가합니다.

Materials