형광 리포터 단백질을 발현하는 박테리아를 이용한 고리형 di-GMP 조절제의 스크리닝

Abstract

출처: Rugjee, K. N., et al. 녹농균에서 c-di-GMP 신호 전달을 조절하는 소분자를 스크리닝하기 위한 고처리량 설정 구축. J. Vis. 경험. (2016).

이 비디오는 c-di-GMP 민감성 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 유전자 변형 박테리아를 사용하여 순환 di-GMP 조절제의 스크리닝을 보여줍니다. 형광은 서로 다른 테스트 화합물을 포함하는 멀티웰 플레이트에서 측정됩니다. c-di-GMP 생성을 억제하는 화합물은 형광을 감소시킵니다. 그런 다음 데이터를 분석하여 박테리아에서 c-di-GMP 신호 전달의 잠재적 조절자를 식별합니다.

Protocol

1. 녹색 형광 단백질(GFP) 태그 순환 di-GMP(c-di-GMP) 리포터 녹농균 균주의 생성

1. 용원성 국물(LB) 배지 5ml에 P. aeruginosa 의 단일 콜로니를 접종하고 200rpm으로 흔들면서 37°C에서 밤새 배양합니다.
2. 하룻밤 배양액 2ml를 1L 플라스크에 담긴 신선한 LB 배지 200ml로 옮기고 200rpm으로 흔들면서 37°C에서 배양합니다.
3. 플라스크에서 1ml 샘플을 채취하고 분광 광도계를 사용하여 검사하여 30분마다 600nm(OD₆₀₀)에서 광학 밀도를 모니터링합니다.
4. OD₆₀₀ 이 0.3 - 0.5 사이에 도달하면 배양액 40ml를 50ml 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다.
5. 4°C에서 10분 동안 8,000rpm에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 상청액을 버리고, 얼음처럼 차갑고 멸균된 300mM 자당 용액 40ml에 세포를 재현탁합니다.
6. 단계 1.5에 설명된 대로 원심분리하여 세포를 두 번째로 펠릿화하고 얼음처럼 차갑고 멸균된 300mM 자당 용액 20ml에 재현탁합니다.
7. 1.5단계에서 설명한 대로 원심분리하여 세포를 마지막으로 ....

Results

그림 1. 소분자 스크리닝 분석에 사용되는 384웰 플레이트 맵. 라이브러리의 화합물(연한 파란색)은 웰 A1-P22에 분취됩니다. 최종 농도 50μg/ml의 토브라마이신 설페이트로 구성된 "양성 대조군"(빨간색)을 웰 A23-P23에 첨가하고, 최종 농도 1% DMSO를 포함하는 "음성 대조군"(녹색)을 웰 A24-P24에 첨가합니다.

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Materials