단클론 박테리아 배양을 준비하는 기술

초록

출처: Lin, P., et al. 박테리아 미네랄 배설을 통한 텅스텐 산 나트륨 및 몰리브덴산 나트륨 마이크로 캡슐 합성. J. Vis. 경험. (2018).

이 비디오는 한천 플레이트에서 연속 희석 및 콜로니 분리를 통해 광물 생산을 위한 단클론 박테리아 배양을 준비하는 방법을 보여줍니다. 유리 구슬로 플레이트를 흔들면 개별 세포가 공간적으로 분리되어 유전적으로 균일한 콜로니를 형성한 다음 성장을 위해 액체 배지로 옮겨집니다. 탁도가 가장 높은 배양물이 선택되어 가장 밀도가 높은 단클론 개체군과 광물 생산의 잠재력이 가장 크다는 것을 나타냅니다.

프로토콜

1. 유리구슬의 준비

1. 직경 3mm의 유리 구슬 100개를 100mL 실험실 병에 넣은 다음 단단히 뚜껑을 닫습니다.
2. 내용물을 120°C에서 10분 동안 오토클레이브합니다.
3. 병을 실온으로 식힌 다음 생물 안전 캐비닛에 넣으십시오.

2. 용원성 국물(LB) 준비

1. LB-Lennox 국물 분말 8g을 500mL 실험실 병에 물 400mL와 함께 녹입니다.
2. 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 자기 교반 막대로 내용물을 20분 동안 저어준 다음 뚜껑을 단단히 닫습니다.
3. 내용물을 120°C에서 10분 동안 오토클레이브합니다.
4. 용액을 실온으로 식힌 후 생물안전 캐비닛에 넣습니다.
5. 피펫을 사용하여 국물을 생물 안전 캐비닛에 있는 8개의 15mL 원심분리 튜브(각각 12.5mL)에 분취합니다.
6. 남은 국물을 생물 안전 캐비닛에 있는 3개의 100mL 실험실 병(각각 100mL)에 분취합니다. 세 병의 뚜껑을 단단히 닫습니다. 생물안전 캐비닛에 보관하십시오.

3. Shewanella 조류의 양식

1. 급속 냉동 보존 균주를 사용하십시오.
2. 생물 안전 캐비닛에서 스테인리스 스틸 주걱으로 냉동 튜브에서 냉동 물질 1mL를 골라 3.5단계에서 준비한 원심분리 튜브에 넣습니다.
3. 배양물을 37°C 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.

4. LB-Lennox(한천 육수) 페트리 접시 준비

1. LB-Lennox(한천이 함유된 국물) 2정을 100mL의 물이 담긴 100mL 실험실 병에 녹입니다.
2. PTFE 마그네틱 교반 막대로 내용물을 20분 동안 저어준 다음 뚜껑을 단단히 닫습니다.
3. 내용물을 120°C에서 10분 동안 오토클레이브합니다.
4. 생물 안전 캐비닛에서 100mL의 용액을 4개의 페트리 접시에 손으로 분취하여 각각 ~25mL를 받도록 합니다. 용액을 실온으로 식히십시오.

5. 단클론 박테리아의 준비

1. 생물 안전 캐비닛에서 2.6단계, #1, #2 및 #3단계에서 준비한 세 개의 병에 각각 라벨을 붙입니다.
2. 3.3단계에서 생성된 박테리아 현탁액 0.1mL를 병 #1에 피펫팅합니다. 병의 뚜껑을 덮고 1분 동안 손으로 휘두르면 균질한 용액이 됩니다.
3. 5.2단계에서 생성된 박테리아 액체 0.1mL를 병 #2에 피펫팅합니다. 병의 뚜껑을 덮고 1분 동안 손으로 휘두르면 균질한 용액이 됩니다.
4. 5.3단계에서 생성된 박테리아 액체 0.1mL를 병 #3에 피펫팅합니다. 병의 뚜껑을 덮고 1분 동안 손으로 흔들어 균질한 용액을 얻습니다.
5. 병 #3의 액체를 4.4단계에서 준비한 4개의 페트리 접시에 각각 0.02mL의 부피를 사용하여 피펫팅합니다.
6. 1.3단계에서 준비한 유리구슬을 사용한 페트리접시 4개, 각 접시에 구슬 4개씩 넣습니다.
7. 페트리 접시의 뚜껑을 닫고 손으로 1분 동안 흔듭니다.
8. 페트리 접시를 거꾸로 뒤집어 37°C 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.

6. 단클론 박테리아의 증식

1. 2.5단계에서 준비된 튜브 7개를 가져옵니다.
2. 스테인리스 주걱으로 5.8단계에서 준비한 4개의 페트리 접시에서 생성된 단클론 박테리아를 골라서 7개의 튜브에 따로 넣습니다.
3. 7개의 튜브를 37°C 인큐베이터에 24시간 동안 그대로 둡니다.
4. 시각적 비색 방법을 사용하여 빛 산란이 가장 큰 것을 선택하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
한천 정제가 포함된 LB(Lennox 국물)	시그마-알드리치	L7075	한천이 함유된 국물 50mL용 1정
LB(레녹스 육수)	시그마-알드리치	엘3022-1KG	LB (레녹스) 파우더 1kg
무수 포도당	Nihon Shiyaku 시약	PL 78695	포도당
50 mL 원심 분리 튜브	송골매	14-432-22
15mL 원심분리 튜브	송골매	14-959-53A
실험실 병 100mL	듀란	21 801 24 5
실험실 병 500mL	듀란	21 801 44 5
스테인레스 스틸 주걱	켐글라스	CG-1981-10
PTFE 일회용 교반 바	어부	S68066
플라스틱 페트리 접시	어부	S33580A
부 화기	고객 제작	맞춤 제작	40°C로 가열하거나 시간 조절로 18°C로 냉각
생물안전 캐비닛	종옌 주식회사	자이브-420	모든 박테리아 관련 프로세스는 여기에서 수행됩니다.
오토 클레이 브	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., 타이베이시, 대만, ROC	TM-329	120°C에서 10분 동안 가열합니다.