열 스트레스를 받는 쥐의 장내 미생물 전좌에 대한 유익한 박테리아의 효과 평가

초록

출처: Sorokulova, I., et al. Bacillus subtilis 균주에 의한 쥐의 열 스트레스 부작용 예방. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 유익한 박테리아 또는 인산염 완충 식염수(PBS)로 전처리되고 장 장벽 무결성을 평가하기 위해 열 스트레스에 노출된 쥐를 보여줍니다. 대조군 쥐의 수많은 콜로니와 달리 치료된 쥐의 간에서 더 적은 장 유래 박테리아 콜로니는 온전한 상피 장벽과 최소한의 박테리아 전좌를 나타냅니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 실험 설계

1. 적응 2일 후 경구 위관으로 동물 치료를 시작합니다. 구강 위관 바늘과 함께 주사기를 사용하십시오. 16마리의 쥐를 Bacillus subtilis BSB3 현탁액(쥐당 1ml)으로 2일 동안 1일 2회 치료합니다(B. subtilis 그룹). 16마리의 쥐를 인산염 완충 식염수인 PBS(쥐당 1ml)로 2일 동안 1일 2회(PBS 그룹)로 치료합니다(그림 1).
2. 치료 후 각 그룹(그룹당 8마리의 쥐)을 세분화합니다: 그룹 1-대조군(PBS/스트레스 없음), 그룹 2-B. 고초(B. subtilis/스트레스 없음), 그룹 3-스트레스(PBS/열 스트레스) 및 그룹 4- B. subtilis + 스트레스(B. subtilis/열 스트레스).
3. 전자 디지털 온도계를 사용하여 각 쥐의 직장 온도를 측정합니다. 그룹 1과 2의 쥐를 실온에서 25분 동안 보관합니다. 그룹 3 및 4의 동물을 45°C 및 55% 상대 습도의 기후 챔버에 25분 동안 놓습니다.
4. 그런 다음 전자 디지털 온도계를 사용하여 모든 그룹의 각 쥐의 직장 온도를 측정합니다. 모든 동물을 실온에 4시간 동안 두십시오.
5. 밀봉 가능한 마취 용기에 이소플루란(2 - 4%)으로 쥐를 마취하고 쥐가 깊게 마취될 때까지 관찰합니다(발가락 꼬집음에 대한 반응 없음). 단두대로 빠르게 참수하여 쥐를 안락사시킵니다.
6. 무발열성 피펫으로 각 쥐의 몸통 혈액(15 - 16ml)을 무발열성 튜브에 채취하여 혈청을 얻고, 현미경 검사를 위해 피펫으로 즉시 혈액 샘플(각 쥐에서 7μl)을 채취합니다.
7. 혈액이 담긴 튜브를 냉장고에 최소 30분 동안 넣어 응고를 허용합니다. 튜브를 20°C, 7,000 x g에서 10분 동안 원심분리한 다음 피펫으로 혈청을 빠르게 제거합니다. 각 쥐로부터 얻은 혈청을 50μl 부피로 분취하고 분석이 끝날 때까지 -20°C에서 보관합니다.

2. 수술 절차

1. 전기 가위로 시체 밑면의 복부와 흉부에서 모든 털을 자르거나 다듬습니다. 시체를 멸균 캐비닛에 넣고 시체의 면도된 표면을 70% 알코올로 처리합니다.
2. 멸균 메스를 사용하여 복부의 정중선 절개를 만듭니다. 멸균 핀셋을 사용하여 각 쥐의 간, 장간막 림프절, 비장 및 소장을 제거합니다.

3. 세균 전좌 분석

1. 간, 장간막 림프절 및 비장의 각 샘플을 미리 무게를 측정한 멸균 튜브에 넣고 무게를 측정합니다. 샘플의 무게는 샘플이 있는 튜브의 무게와 빈 튜브의 무게의 차이로 계산합니다.
2. 멸균 PBS를 튜브에 첨가하여 샘플의 1:10 희석액(부피당 중량, w/v)을 얻고 멸균 유리 조직 균질화기로 각 샘플을 균질화하여 균질한 현탁액을 얻습니다.
3. 멸균 PBS에서 각 샘플의 연속 희석액(^10-1 내지 ^10-4)을 만듭니다. 각 조직의 모든 희석액 0.1ml를 헤민(0.005g/L) 및 비타민 K1(0.01g/L) 플레이트와 함께 MacConkey's 및 5% 혈액 한천 및 브루셀라 혈액 한천 표면에 도금합니다.
4. MacConkey's 및 5% 혈액 한천 플레이트를 호기성 방식으로 배양하고 Brucella 혈액 한천 플레이트를 37 ^°C의 혐기성 조건에서 배양합니다.
5. 콜로니 카운터를 사용하여 24시간 후에 호기성 박테리아의 콜로니를 계산하고 배양 48시간 후에 혐기성 박테리아의 콜로니를 계산합니다. 결과를 조직 그램의 콜로니 형성 단위(CFU) 수로 표현합니다.

결과

그림 1. 연구 설계. 쥐 2개 그룹(각 그룹당 16마리의 쥐)을 Bacillus subtilis BSB3(B. subtilis 그룹) 또는 PBS(PBS 그룹)로 1일 2회 경구 위관으로 치료했습니다. 3일째에 각 그룹을 각 그룹에서 8마리의 쥐로 세분화했습니다. 그룹 3과 4의 쥐를 45°C에서 25분 동안 두었다. 대조군 동물(그룹 1 및 2)을 실온에 보관했습니다.

재료