유세포 분석을 이용한 Microcystis aeruginosa 의 생존율 분석

초록

출처: Chapman, I. J., et al., 유세포 분석을 사용하여 광합성 유기체(Microcystis aeruginosa)의 세포 사망률을 결정하기 위한 분자 프로브 최적화. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 형광 프로브 표지와 피코시아닌 자가형광 및 프로브 신호의 유세포 분석을 결합하여 살아있는 세포와 죽은 녹농미세낭 충 세포를 구별하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 분자 프로브 세포 흡수 최적화

1. M. aeruginosa의 배양액의 절반을 기하급수적으로 수확하여 '살아있는' 대조군으로 사용합니다.
   참고: 고밀도 배양에서 기하급수적으로 직접 희석된 샘플은 초기 지연/유도 단계에서 접종된 배양물과 비교하여 사세포 회전율을 통해 최적화 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.
2. 나머지 절반은 70% 에탄올, 60 ^°C에서 1시간 동안 가열 샘플, 파라포름알데히드 또는 4% 포름알데히드를 30분 동안 가열하는 등의 방법을 사용하여 '죽은' 대조군으로 준비합니다. 샘플의 미세 환경(예: pH)의 변화를 확인합니다.
   참고: M. aeruginosa 의 양성, 열사멸, '죽은' 대조군은 피코시아닌 신호의 감소를 통해 '살아있는' 샘플과 구별됩니다. 다른 방법으로 사망을 유도해도 동일한 결과가 발생하지 않을 수 있으며 종에 따라 다를 수 있습니다.
3. '살아있는' 샘플과 '죽은' 샘플의 서로 다른 비율(예: 0%, 25%, 50%, 100%)을 사용하여 혼합 샘플을 설정합니다.
4. 소용돌이 또는 초음파 처리에 의해 콜로니 형성을 분해하고 pH를 확인하십시오.
5. 녹색(형광 채널 1 또는 FL1, 530 ± 15 nm) 및 주황색(형광 채널 2 또는 FL2, 585 ± 20 nm) 핵산 프로브 및 640nm 레이저에서 형광을 기록할 수 있는 검출기와 함께 488nm 레이저를 선택하여 각 검출기를 통해 피코시아닌 신호를 기록합니다.
   참고: DNA에 결합했을 때 녹색 핵산 프로브는 대략적인 형광 여기 파장이 504nm이고 방출 최대값이 523nm인 반면, 주황색 핵산 프로브는 547nm의 여기 파장과 570nm의 방출 최대값을 갖습니다. 488nm 아르곤 이온 고체 레이저를 사용하여 두 분자 프로브를 모두 여기시킬 수 있지만 녹색 레이저(최대 547nm)는 더 높은 주황색 형광을 생성합니다.
6. 출발점으로 제조업체가 권장하는 농도의 분자 프로브를 50% '살아있는' 배양물과 50% '죽은' 배양액에 도입하고 어두운 곳에서 배양합니다.
7. 새 데이터 셀을 선택하고 배경 노이즈(FSC-H 또는 전방 산란 높이, 80,000)를 줄이는 임계값 및 트리거가 있는 샘플 도입 포트(SIP) 아래에 샘플을 배치합니다.
8. FSC-H 및 SSC-H(측면 산란 높이) 매개변수와 세 개의 히스토그램을 사용하여 밀도 플롯을 생성합니다. 각 분자 프로브 광학 검출기 채널(FL1 또는 2)을 사용하는 히스토그램 하나, 피코시아닌 방출(형광 채널 4 높이 또는 FL4-H)을 검출하는 히스토그램, FSC-H를 모두 로그 스케일로 사용합니다.
9. M. aeruginosa를 핵산 프로브와 함께 어둠 속에서 최대 60분 동안 배양하고, 다양한 시점(1, 5, 10, 15, 30 및 60분)에서 별도의 데이터 셀에 기록합니다.
   참고: pH와 같은 매개변수를 조정할 때 특정 화학 물질로 인한 잠재적 반응에 대해 제조업체에 확인하십시오(테스트된 핵산 프로브의 경우 완충액은 DNA와의 결합이 감소하므로 인산염 또는 높은 수준의 1가 또는 2가 양이온을 포함할 수 없습니다).
10. 소프트웨어 게이트를 적용하여 각 형광 프로브 채널 히스토그램에 표적 유기체의 세포 크기에 대한 FSC-H 히스토그램(320,000 - 1,500,000)만 포함합니다.
    참고: 이 프로토콜에 사용된 농도는 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 및 100μM이며, 이는 M. aeruginosa 의 부피 또는 핵 프로브의 초기 원액을 증가시키거나 감소시켜 변경할 수 있습니다.
11. 형광 프로브 채널에서 히스토그램의 가장 높은 피크(녹색 FL1-H, 240,000 - 1,650,000, 주황색 FL2-H, 30,000 - 165,000)에 또 다른 포괄적 소프트웨어 게이트를 적용한 다음 해당 양성 프로브 형광을 밀도 플롯으로 게이트합니다.
12. 100% "살아있는 것", 100% "죽은 것" 및 모든 혼합 배양 샘플로 3.1 - 3.11단계를 실행하고 필요한 경우 분자 프로브 농도(예: x 0.1 - x 10) 및/또는 온도 및 pH 수준을 조정합니다.
13. 양성 분자 프로브 형광 신호의 수를 '죽은' 세포의 원래 세포 밀도(전체 FSC-H의 절반 또는 100% '죽은' 배양에서 채취)와 비교하여 핵산 프로브로 염색된 세포의 총 비율을 찾습니다.
14. 비특이적 염색을 생성하지 않고 세포 핵 프로브 흡수의 가장 높은 비율을 위한 최적의 프로토콜을 찾기 위해 각 농도 내의 각 기간에 대해 이 작업을 수행합니다(데이터가 비모수적인 경우 단방향 분산 분석, ANOVA 또는 Kruskal-Wallis 일원 분산 분석의 평균 사용).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시아노박테리아 미디어	시그마-알드리치	C3061-500ML	BG-11 담수 농축 용액(x50 희석)
오염 제거 유체	BD 바이오사이언스	653155	출력이 고속 또는 66 μl/min의 유속에서 초당 12개 이상의 이벤트일 때 2분 동안 실행합니다. 이어서 2분 동안 시스 H2O를 사용합니다.
유세포 분석기	BD 바이오사이언스	요청에 따라	BD 아큐리 C6
시톡스 그린	라이프 테크놀로지	S7020	핵산 염색 – DMSO의 5 mM 용액
SYTOX 오렌지	라이프 테크놀로지	S11368	핵산 염색 – DMSO의 5 mM 용액