방법 논문

한천 우물 확산 분석을 사용한 Nisin 변이체의 항균 활성 평가

2025년 10월 30일

이 논문에서

초록

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출처: Nickling, J. H., et.al. 비표준 아미노산의 선택적 압력 통합에 의해 생산되는 항균 펩타이드. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 nisin 변이체의 항균 활성을 평가하는 데 사용되는 한천 우물 확산 분석을 보여줍니다. 막 결합 펩티다제 NisP를 발현하는 락토코커스 락티스 가 대 장균에서 생성된 니신 전구체를 활성화하여 성장 억제 후광을 일으키는 방법을 보여줍니다. 이러한 후광의 크기는 각 니신 변이체의 생체 활성을 반영합니다.

프로토콜

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1. 항균 활성 테스트

  1. 멸균 조건에서 GM17-한천 플레이트의 준비
    1. 1%(w/v) 포도당(=GM17) 및 5μg/mL 클로람페니콜이 포함된 M17 국물에서 30°C에서 플라스미드 pNG nisPT를 운반하는 지표 균주 L. lactis NZ9000의 하룻밤 배양을 준비합니다.
    2. OD600을 측정하고 신선한 배지를 OD600 = 0.1로 접종하고 OD600 = 0.4-0.6이 될 때까지 배양합니다. 그런 다음 플라스크를 얼음 위에 놓습니다.
      메모: 각 OD600 측정은 배양량을 소비합니다. 각 분석 한천 플레이트에 대해 1mL의 박테리아 배양이 필요하다는 점을 명심하십시오. 필요한 경우 그에 따라 액체 배양 부피를 확장하십시오.
    3. 1.5% 한천의 경우 유리 배지 병에 한천 4.5g의 무게를 잰다. 300mLddH2O를 첨가하고 혼합한 후 오토클레이브합니다.
    4. 300mLddH2O에 2x M17 국물(2회 농축)을 준비하고 오토클레이브합니다.
    5. 10μg/mL 클로람페니콜 및 2% 포도당을 함유한 25mL 2x M17 국물을 1mL L. lactis 전배양(4% v/v)과 혼합합니다.
    6. 용융된 1.5% 한천 25mL를 추가합니다(갓 고압멸균하거나 전자레인지에 가열).
      메모: 그 전에 병을 만졌을 때 식히십시오(약 50°C). L. lactis 는 고온에 민감한 중온성 유기체이기 때문에 필요합니다.
    7. 용액을 큰 페트리 접시에 붓습니다. 10-15분 동안 플레이트를 건조시킵니다.
    8. 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 화염으로 소독합니다. 식을 때까지 기다린 다음 넓은 끝을 사용하여 응고된 GM17-한천에 구멍을 만듭니다.
  2. 시료 준비
    1. 표지된 1.5mL 튜브에 1mL의 대장균 발현 배양균을 취하고 7,000 x g에서 3분 동안 원심분리합니다. 나머지 배지를 흡인하고 세포 펠릿을 500μL Na-P(50mM 인산나트륨 완충액, 0.5M 인산이수소나트륨 및 0.5M 인산수소이나트륨으로 만든 pH 7.4)에 재현탁합니다.
    2. 얼음 위에서 샘플을 초음파 처리하십시오. 초음파 처리기 프로브의 끝을 세포 현탁액에 담그십시오. 초음파 발생기를 30 분 동안 1 초 켜고 5 초의 펄스로 3 % 진폭으로 설정합니다.
    3. 세포 용해물을 13,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다. 상청액을 얼음 위의 새 반응 튜브로 옮깁니다.
    4. 세포 추출물 상청액을 Na-P로 수확된 세포 밀도에 대해 1mL OD600 = 0.6으로 희석하고 정규화합니다.
  3. 활동 테스트
    1. 각 정규화된 샘플 40μL를 지시약 한천 플레이트의 구멍에 추가합니다 (그림 1). 항균 대조 화합물로 400μg/mL의 클로람페니콜을 사용합니다. 용출 완충액을 음성 대조군으로 사용합니다. 모든 샘플이 한천으로 확산될 때까지 기다리십시오. 플레이트를 30°C에서 밤새 배양합니다.
    2. 평판 스캐너나 디지털 카메라를 사용하여 한천 플레이트의 사진을 찍습니다. 성장 억제 후광 크기는 손으로 또는 ImageJ를 사용하여 측정할 수 있습니다.

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결과

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그림 1. 프롤린 유사체와 함께 SPI를 통해 생산된 니신 변이체를 포함하는 세포 용해물의 항균 활성 분석. 니신 변이체와 재조합 야생형 샘플의 비교. 모든 샘플은 수확된 세포 배양 밀도에 비해 세포 용해 후 OD600 정규화되었습니다. 후광은 지표 균주 성장 억제의 형태로 생체 활성을 나타냅니다. 첫 번째 행은 왼쪽에서 오른쪽으로: (4<...

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인산이수소나트륨 일수화물Carl Roth, 독일K300.2 
인산수소이나트륨Carl Roth, 독일P030.2 
D-포도당Carl Roth, 독일6780용융된 한천에 첨가할 20%(w/v) 용액을 준비합니다.
클로람페니콜Carl Roth, 독일3886.1L. lactis의 경우 작동 농도 5 μg/mL, 에탄올에 37 mg/mL 스톡을 준비합니다.
M17-국물Sigmal-Aldrich, 독일56156상용 제품
한천Carl Roth, 독일5210.5 
락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 니신Sigma-Aldrich, 독일N5764상용 제품, 생체 활성에 대한 참조로 사용할 수 있습니다.
1.5mL Eppendorf 튜브Eppendorf, 독일30120086 
페트리 접시(폴리스티렌, 멸균)Carl Roth, 독일TA19 
락토코커스 락티스 NZ9000 pNG 니스PT  박테리아 지표 균주
1.5 mL Eppendorf 튜브용 탁상용 원심분리기Eppendorf, 독일5427 원 
프로브 초음파 발생기Bandelin, 독일Sonotrode MS-72가 있는 Sonopuls HD3200최대 200W HF 출력

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Lactococcus lactisNisP

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