낭포성 섬유증 폐 가래를 생체 외에서 모방하기 위한 인공 가래 배지의 준비

초록

출처: Vieira, J., et al. 낭포성 섬유증 기도 마이크로바이옴에 대한 보충 산소의 효과를 연구하기 위한 모델의 설계 및 개발. J. Vis. 경험. (2021).

이 비디오는 낭포성 섬유증 폐 가래의 점도, 영양 조성 및 pH를 모방한 인공 가래 배지의 준비를 보여줍니다. 생성된 배지는 생체 외 연구를 위한 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

1. 인공 가래 배지 준비

메모: 여기에 나열된 양은 최종 인공 가래 배지 1L의 생산을 위한 것이며 재료표에 나열된 특정 시약을 가정합니다. 동일한 최종 제품을 보장하기 위해 다른 부피 또는 다른 시약의 사용에 대해 숫자를 조정해야 합니다. 목표 농도는 표 1 을 참조하십시오.

1. 인공가래 화학 혼합물(ASCM)
   메모: ASCM은 최종 중간 부피의 25%를 차지합니다. 상온 보관이 가능하며 대량으로 또는 미리 준비할 수 있습니다. 나중에 사용할 준비가 되어 있는 경우 화학 혼합물을 오토클레이브하고 실온에서 안전하게 보관하십시오.
   1. 구성 화학 원액을 혼합합니다.
      1. 1M NaCl 스톡 준비: 멸균수 리터당 58.44g의 NaCl을 첨가합니다.
      2. 1M KCl 스톡 준비: 멸균수 리터당 74.55g의 KCl을 추가합니다.
      3. 1M MgSO₄ 스톡 준비: 멸균수 리터당 246.47g의 MgSO₄·7H_2O또는 멸균수 리터당 120.37g의 무수 MgSO₄ 를 첨가합니다.
      4. 1M 포도당 스톡 준비: 멸균수 1리터당 포도당 180.16g의 포도당을 첨가합니다.
   2. 화학 원액과 빈 250mL 병을 오토클레이브 멸균합니다. 30분 동안 최소 표준 값인 121°C 및 15PSI로 고압멸균 단계를 수행합니다.
   3. 빈 250mL 병에 80.59mL의 멸균수를 추가합니다.
   4. 152.30mL의 1M NaCl 스톡을 혼합물에 첨가합니다.
   5. 15.8mL의 1M KCl 스톡을 혼합물에 첨가합니다.
   6. 혼합물에 610μL의 1M MgSO₄ 스톡을 첨가합니다.
   7. 혼합물에 700μL의 1M 포도당 스톡을 첨가합니다.
2. 인공 가래 뮤신 믹스(ASMM)
   메모: ASMM은 최종 중간 부피의 50%를 차지합니다. 최종 중간 배치와 같은 날 준비되었는지 확인하십시오.
   1. 빈 1L 병에 멸균수 450mL를 추가합니다.
   2. 10x 인산염 완충 식염수(PBS) 50mL를 병에 추가합니다.
   3. 병에 일회용 마그네틱 교반 바를 추가합니다.
   4. PBS가 들어 있는 병과 교반 바를 오토클레이브합니다.
   5. 뮤신 분말 10g을 계량하여 PBS에 첨가합니다.
   6. 예비 혼합을 위해 병을 세게 흔듭니다.
   7. 마그네틱 교반기가 있는 핫 플레이트에 병을 놓습니다. 열을 50°C를 목표로 하고 교반 속도를 1100rpm으로 중간 높이로 설정합니다. 막대가 자석에서 날아가지 않도록 속도를 서서히 높이십시오.
      1. 가열하고 15분 동안 저어줍니다.
      2. 내열 장갑을 끼고 병을 집어 들으십시오. 뮤신 분말이 용액에서 가라앉는지 관찰하십시오.
      3. 뮤신 분말이 완전히 녹지 않으면 완전히 녹을 때까지 5분 간격으로 병을 가열/교반기에 다시 넣으십시오.
   8. 뮤신 혼합물을 실온으로 식히십시오.
3. 인공 가래 생물학적 혼합물(ASBM)
   메모: ASBM은 최종 중간 부피의 25%입니다. 최종 중간 배치와 같은 날 준비하고 다른 혼합물과 달리 구성 요소를 열에 노출시키지 마십시오.
   1. 100x 비타민 스톡을 4°C 냉장고 또는 얼음 위에서 해동합니다. ​
      메모: 동결/해동 주기 횟수를 최소화하기 위해 비타민 스톡을 10mL 분취량으로 미리 나눕니다.
   2. 빈 고압멸균 250mL 병에 멸균수 124.24mL를 추가합니다.
   3. 혼합물에 50x 필수 아미노산 스톡 25.76mL를 첨가합니다.
   4. 100x 비필수 아미노산 스톡 80.14mL를 혼합물에 첨가합니다.
   5. 혼합물에 (해동된) 100x 비타민 스톡 10mL를 추가합니다.
   6. 1000x 미량 금속 스톡 1mL를 혼합물에 첨가합니다.
   7. 혼합물에 30% 달걀 노른자 에멀젼 8.33mL를 첨가합니다.
   8. 혼합물에 10g/L 페리틴 스톡 400μL를 첨가합니다.
   9. 수동 쉐이킹을 통해 용액을 잘 섞습니다.
4. 인공 가래 배지(ASM)
   1. ASMM이 들어 있는 1L 병에 250mL의 ASCM을 추가합니다.
   2. 250mL의 ASBM을 중간 병에 추가합니다.
   3. 염기성 MOPS 완충액(1M)으로 배지를 적정하여 좁은 범위의 pH 용지에서 pH 6.3에 도달합니다. 적정 전에 중간 혼합물은 너무 산성입니다.
   4. 생성된 인공 가래 배지를 여과 준비가 될 때까지 4°C에서 냉장 보관합니다.
   5. 여과 과정을 시작하려면 여과되지 않은 인공 가래 배지 200mL를 0.22μm 기공 크기 필터가 있는 진공 여과 시스템으로 옮깁니다.
   6. 여과 시스템을 진공 펌프에 연결하고 진공 펌프를 켜고 70mbar로 설정한 다음 4°C의 냉장실에서 90rpm으로 흔들리는 궤도 셰이커에 챔버를 놓습니다.
      1. 상당한 양이 여과되므로 배지 150mL를 추가로 채웁니다. 1L의 배지를 완전히 여과하는 데 1-2일이 걸립니다.
      2. 모든 매체가 여과될 때까지 추가 챔버로 반복합니다.
         메모: 시간이 지남에 따라 뮤신이 필터를 막을 수 있으므로 동일한 0.22μm 필터를 통해 350mL 이상의 배지를 여과하지 마십시오.
   7. 여과된 인공 가래 배지를 사용할 준비가 될 때까지 4°C에서 냉장 보관합니다. 최상의 결과를 얻으려면 준비 후 1개월 이내에 ASM을 사용하십시오.

표 1: 문헌 검토에서 도출된 인공 객담 배지 레시피. (열 1) 인공 객담 배지 제형의 시약 및 핵심 값. (2-7열) 현존하는 문헌의 레시피 비교. (8-9열).

열 1		열 2	칼럼 3	칼럼 4	열 5	칼럼 6	칼럼 7	칼럼 8	칼럼 9
값		컴스톡	키르치네르	스리라물루	팔 머	플 린	갤러거	라이	근원
뮤신		2% w/v	0.5% w/v	0.5% w/v	-	1% w/v	2% w/v	1% w/v	플 린
소금		85.5 밀리미터	85.5 밀리미터	85.5 밀리미터	66.6 밀리미터	89.8 밀리미터	85.5 밀리미터	152.3 밀리미터	라피에르
염화칼륨		29.5 밀리미터	29.5 밀리미터	29.5 밀리미터	15.8 밀리미터	-	2.95 밀리미터	15.8 밀리미터	팔 머
황산마그네슘		-	-	-	0.6 밀리미터	1 밀리미터	1 밀리미터	0.61 밀리미터	팔 머
황산철		-	-	-	0.0036 밀리미터	-	-	-	-
염화암모늄		-	-	-	2.3 밀리미터	60 밀리미터	-	-	-
인산일칼륨		-	-	-	2.5 밀리미터	60 밀리미터	-	-	-
포도당		-	-	-	3.2 밀리미터	13 밀리미터	40 밀리미터	0.7 밀리미터	삼비크
젖산		-	-	-	9 밀리미터	-	-	-	-
필수 아미노산		14.45배	0.25g/L	0.25g/L	산당	0.5배	0.375배	1.29배	팔 머
비필수 아미노산		28.9배	0.25g/L	0.25g/L	산당	0.25배	0.5배	8.01배	팔 머
비타민		-	-	-	-	-	1배	1배	갤러거
미량 금속		-	-	-	-	1배	1배	1배	플 린
달걀 노른자		0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	키르치네르
페리틴		0.0003 그램/리터	-	-	-	-	0.0004 그램/리터	0.0004 그램/리터	갤러거
연어 정자 DNA		1.4 그램/리터	4g/L	4g/L	-	-	1.4 그램/리터	-	-
DPTA		-	-	0.0059 그램/리터	-	-	-	-	-
pH		-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	라피에르
보관		0	4°	-	-	4°	4°	4°	키르치네르
멸균		오토 클레이 브	필터	오토 클레이 브	-	오토 클레이 브	오토 클레이 브	필터	키르치네르

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
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크림퍼, 30mm	DWK 생명 과학	224307	혈청 병에 알루미늄 씰을 부착하기 위한 크림퍼.
D-(+)-포도당	밀리포어시그마	지7021	고체 포도당 분말(우회전성 이성질체).
다이어프램 펌프 ME 2 NT	진공 브랜드	20730003	진공 여과용 진공 펌프.
달걀 노른자 에멀젼	하이미디어	FD045	식염수에 달걀 노른자 30%의 멸균 에멀젼.
페리틴, 말 비장에서 양이온화	밀리포어시그마	F7879	페리틴(철 저장 단백질) 용액.
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하이드리온 pH 용지 (1.0–14.0)	마이크로 에센셜 연구소	94	1.0–14.0 범위의 pH 시험지.
하이드리온 pH 용지(4.0–9.0)	마이크로 에센셜 연구소	55	4.0–9.0 범위의 pH 시험지.
하이드리온 pH 용지(6.0–8.0)	마이크로 에센셜 연구소	345	6.0–8.0 범위의 pH 시험지.
피하 주사 바늘-Pro EDGE 안전 장치, 18g	스미스 메디컬	401815	안전 캡이 있는 18G 바늘.
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라이닝 없는 알루미늄 씰, 30mm	DWK 생명 과학	224187-01	고무 마개 위에 압착된 알루미늄 씰.