초파리 파리에서 장내 관련 박테리아의 군집 형성 단위의 정량화

초록

출처: Dodge, R., et al. 초파리 마이크로바이옴에 적용된 96웰 플레이트 형식의 빠른 콜로니 형성 단위 계수. J. Vis. 경험. (2023년)

이 비디오는 연속 희석 및 도금 접근법을 사용하여 초파리 파리의 장내 관련 박테리아의 콜로니 형성 단위(CFU)를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 장내 세균을 포함하는 균질화된 파리 샘플을 연속적으로 희석하고 한천에 도금한 다음 배양하여 콜로니 성장을 허용합니다. 그런 다음 소프트웨어를 사용하여 플레이트의 이미지를 분석하여 각 지점의 콜로니를 정렬, 분할 및 계산하여 정확한 CFU 정량화를 가능하게 합니다.

프로토콜

1. 96웰 PCR 플레이트에서 파리를 개별적으로 균질화

1. 구슬 비터 접시를 미리 준비하십시오.
   1. 0.5μm 유리 구슬( 재료 표 참조)을 구슬 측정 트레이에 붓습니다. 모든 우물이 가득 차고 수평이 되도록 트레이에 구슬을 펴고 여분의 구슬을 원추형 튜브에 털어내어 회수합니다.
   2. 세미 스커트 중합효소 연쇄 반응(PCR) 플레이트( 재료 표 참조)를 측정 트레이에 거꾸로 놓고 트레이의 움푹 들어간 부분에 끼워 웰과 정렬합니다. 그런 다음 빠르게 뒤집어 구슬을 옮깁니다.
   3. PCR 플레이트 표면에서 여분의 비드를 제거하고 호일로 덮습니다. PCR 플레이트를 검사하여 모든 웰에 구슬이 포함되어 있는지 확인합니다. 단일 웰에 비드를 추가하는 데 필요한 경우 계량 스쿱을 사용하십시오. 정전기로 인해 플레이트 표면에 비드가 달라붙는 경우 측정 트레이와 PCR 플레이트의 뒷면을 70% 에탄올로 닦거나 분사하십시오.
   4. 알루미늄 호일로 덮으십시오. 많은 플레이트를 이러한 방식으로 준비한 다음 나중에 사용할 수 있도록 고압멸균하여 보관할 수 있습니다. 사용할 준비가 되면 96채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 100μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가합니다( 재료 표 참조).
2. 균질화하기 전에 미생물이 서식한 파리를 70% 에탄올로 표면 멸균합니다.
   1. 파리를 100%_CO2 로 5초 동안 마취합니다. 작은 깔때기를 사용하여 바이알에서 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 마취된 파리를 옮깁니다(그림 1A-2). 이 연구에서는 일반적으로 튜브당 25마리의 파리가 추가되었습니다.
   2. 즉시 ~1mL의 70% 에탄올을 튜브에 분사하고 튜브를 닫은 다음 10초 동안 반전하여 혼합합니다. 그런 다음 파리가 흡인되지 않도록 주의하면서 P1000 피펫으로 에탄올을 흡인합니다. 에탄올로 다시 한 번 반복한 다음 멸균 PBS로 두 번 반복합니다(그림 1A-3).
3. 최종 PBS 세척 후 튜브를 닫고 캡 면이 아래로 향하도록 벤치에서 몇 번 세게 두드려 파리가 캡 안으로 들어가도록 합니다.
4. 튜브를 열고 집게를 사용하여 파리를 우물에 분배합니다(그림 1A-4). 각 웰에 플라이 한 마리를 놓습니다(그림 1A-5). 파리를 마취한 상태를 유지하기 위해 적재하는 동안 접시를 얼음 위에 보관하십시오.
5. Thermal Bond 열 밀봉 호일을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다( 재료 표 참조).
   1. 먼저, 호일 씰에 누출을 일으킬 수 있으므로 우물 근처에 있는 흩어진 구슬을 제거하십시오. 호일의 무딘 면이 플레이트에서 아래를 향하고 반짝이는 면이 열 실러 쪽으로 향하는지 확인하십시오. 열 실러( 재료 표 참조)를 5초 동안 단단히 누릅니다(그림 1A-6). 핸드 어플리케이터( 재료 표 참조)로 광택을 내어 호일을 고정합니다.
      참고: 밀봉 불량은 샘플 손실의 원인입니다.
6. 플레이트 셰이커에 플레이트를 고정합니다. 5분 동안 균질화합니다(그림 1A-7). 미니 플레이트 스피너( 재료 표 참조)에서 비드 플레이트를 350 x g 으로 30초 동안 회전시켜 밀봉 호일에서 액체를 제거합니다.
7. 우물 밖으로 파리 균질액 방울이 튀지 않도록 플레이트를 잡고 호일을 제거합니다.

2. 플라이 균질의 연속 희석 및 CFU 플레이트에 스포팅

1. 4개의 직사각형 de Man, Rogosa, and Sharpe(MRS) 한천 성장판( 재료표 참조)을 생물안전 캐비닛에 넣고 뚜껑을 제거합니다. 이 프로토콜에서 MRS 한천은 L. plantarum의 성장에 사용되었습니다. 이 접시를 최소 10분 동안 건조시킵니다(갓 부었거나 보관에서 차갑게 보관한 경우 20분).
   참고: 플레이트가 젖으면 96웰 플레이트의 물방울이 함께 흐르고 카운트를 망칩니다.
2. 96채널 피펫터를 사용하여 멸균 96웰 플레이트의 각 웰에 100μL의 PBS를 첨가하여 3개의 희석 플레이트를 준비합니다. P20 팁 랙을 96채널 피펫터에 로드합니다.
3. 섹션 1에서 준비된 샘플 플레이트에서 11.1μL의 균질염을 흡인하여 1:10 희석액을 만듭니다(그림 1A-8). 파리 균질물과 유리 구슬이 피펫을 막을 수 있으므로 우물 바닥이 아닌 우물 중앙에서 끌어야 합니다. 구슬이 가라앉고 파리 미립자가 떠다니며 중간층은 대부분 투명하게 남습니다.
4. 웰당 이미 100μL의 멸균 PBS가 들어 있는 첫 번째 희석 플레이트에 11.1μL를 분배합니다. 희석판을 분당 600회전(rpm)으로 10초 동안 플레이트 셰이커에 보관합니다. 5주기 동안 위아래로 피펫팅하여 다시 혼합합니다. 첫 번째 희석 플레이트에서 두 번째 희석 플레이트로 11.1 μL를 옮기고 다음 두 희석 플레이트에 대해 혼합 단계를 반복합니다.
5. 아래 설명과 같이 희석 시리즈 도금을 수행합니다.
   1. 생물 안전 캐비닛에서 성장판을 회수합니다.
   2. 가장 묽은 플레이트부터 시작하여 96웰 피펫터를 사용하여 각 웰에서 한천 플레이트에 2μL를 쏴냅니다(그림 1A-9).
      1. 한천에 찔리지 않도록 주의하면서 피펫터 헤드를 플레이트 위로 천천히 내립니다. 접시를 주의 깊게 검사하고 모든 스팟이 분배되었는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 적절한 위치에 2μL를 수동으로 추가합니다. 액체 반점이 한천에 빠르게 스며들고 함께 흐르지 않는지 확인하십시오.
      2. 반점이 함께 흐르면 새 새 한천 플레이트 세트를 더 오랜 기간 동안 건조시키고 얼룩을 다시 실행하십시오. 여러 플레이트 유형(예: 다른 배지 또는 항생제 포함)이 있는 경우 해당 플레이트도 찾아냅니다. 남은 용액을 희석판에 다시 분배하고 다음으로 더 높은 농도로 진행합니다.
         알림: 희석액을 발견할 때 다음 희석액을 5회 혼합하여 피펫 팁의 내용물이 이전 희석액에서 제거되었는지 확인합니다. 희석 플레이트는 콜로니 수에 영향을 주지 않고 4°C에서 >8시간 동안 보관할 수 있습니다.
6. 나머지 희석 플레이트에 대해 2.5단계에서 설명한 대로 도금 과정을 반복하여 원래 균질이 있는 플레이트가 될 때까지 가장 희석된 것에서 가장 농축된 것으로 진행합니다.
7. 모든 액체가 한천에 흡수되면 플레이트를 뒤집어 인큐베이터에 넣습니다(그림 1A-10). 초파리의 Lactiplantibacillus 및 Acetobacter의 경우 MRS 배지에서 최적의 온도는 30°C입니다. 콜로니가 최적의 크기에 도달할 때까지 배양합니다: 콜로니는 명확하게 볼 수 있을 만큼 크지만 서로 합쳐지거나 성장을 방해할 정도로 크지는 않습니다(최적의 크기의 정량화에 대한 대표 결과 참조).
   참고: 최적의 성장 조건은 균주에 따라 다르며 경험적으로 결정되어야 합니다. 초파리의 Lactiplantibacillus의 경우 최적의 배양 시간은 MRS 한천에서 26시간에서 30시간입니다. 초파리의 아세토박터의 경우 균주에 따라 MRS에서 최적의 배양 시간은 30시간에서 48시간입니다.
8. 배양 후, 계수 준비가 될 때까지 필요한 경우 플레이트를 4°C에서 보관합니다.

3. 콜로니 형성 단위(CFU)의 정량화

1. 아래에 설명된 대로 플레이트를 촬영한 다음 자동화된 소프트웨어를 사용하여 콜로니를 계산하여 CFU를 정량화합니다. 플레이트를 4°C에서 보관한 경우 먼저 실온에 도달하여 플레이트에 결로가 발생하여 눈부심이 발생하지 않도록 하십시오.
2. 플레이트를 논리적인 순서로 구성하고 사진을 찍는 동안 해당 순서로 유지하면 파일 이름을 더 쉽게 지정할 수 있습니다. A1이 모든 플레이트의 왼쪽 상단 모서리에 있도록 모든 플레이트의 방향을 지정합니다. 사진이 혼동되지 않도록 A1 모서리에 고유 ID로 라벨을 붙이는 것이 좋습니다. 각 희석 시리즈를 순서대로 쌓습니다.
3. 플레이트 뚜껑을 제거하고 플레이트를 스테이지에 놓고 A1이 올바른 모서리를 향하도록 합니다. 플레이트 포토 박스는 이러한 트레이 플레이트 촬영에 최적화되어 있으며 형광 콜로니를 이미지화하기 위한 조명 및 필터 옵션이 포함되어 있습니다.
4. 플레이트를 이미지화합니다. 수동 설정과 함께 카메라( 재료 표 참조)를 사용하여 플레이트 간에 일관된 노출 수준을 달성하십시오. 원근 왜곡을 최소화하기 위해 긴 초점 거리 설정을 권장합니다. 카메라 흔들림으로 인한 흐림을 최소화하기 위해 원격 셔터를 사용하여 사진을 캡처합니다.
5. 이미지를 컴퓨터로 전송하고 실험 이름, 미디어 유형, 희석 계수 및 기타 관련 세부 정보를 포함하여 이름을 바꿉니다. 일부 운영 체제( 재료 표 참조)에는 선택한 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 Finder에서 유용한 일괄 이름 바꾸기 기능이 있습니다.

4. Count-On-It 제품군을 사용한 자동 콜로니 계수

1. ImageJ용 제공된 Croptacular 플러그인을 사용하여 이미지를 자릅니다. 이 플러그인은 이미지를 순서대로 배열된 하위 영역(예: 96웰 플레이트의 경우 8 x 12)으로 나누는 데 도움이 됩니다. 하위 지역은 개별적으로 계산됩니다.
   1. 정량화를 위해 처리할 이미지를 폴더로 구성합니다. 플레이트를 구별하는 파일 이름을 선택하면 이러한 파일 이름이 각 카운트 세트의 열 제목이 됩니다. 이 폴더 내에서 "cropped" 및 "receipts"라는 하위 폴더를 만듭니다.
   2. Croptacular를 실행하고 확인을 클릭하여 자르기를 시작합니다.
      참고: 기본 설정이 표시되며 일반적으로 충분합니다. 이미지의 해상도, 조명, 스폿 크기 등에 따라 기본 매개변수를 조정하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
   3. 이미지가 이미 직선이면 스페이스를 누르기만 하면 됩니다. 그렇지 않으면 수평이 되어야 하는 가장자리를 따라 선을 그려 이미지를 곧게 펴십시오. 이미지가 여전히 똑바르게 보이지 않으면 필요한 만큼 선을 다시 그립니다.
   4. 다음으로 계산을 수행할 영역의 경계 상자를 그립니다. 모든 반점이 셀 내에 있을 때까지 크기와 비율을 조정합니다. 커서를 경계 상자 외부로 끌어 그리드를 새로 고칩니다. 그리드가 좋아 보이면 스페이스를 누릅니다.
   5. 다음 이미지가 첫 번째 이미지와 동일한 각도로 자동으로 회전하는지 확인하십시오. 플러그인은 모든 사진이 동일하게 정렬되어 있다고 가정합니다. 이것이 정확하면 스페이스바 를 눌러 계속합니다. 그렇지 않으면 이전과 같이 이미지를 똑바르게 합니다. 그리드는 또한 이전 이미지와 동일한 위치를 불러옵니다. 필요한 경우 조정한 다음 스페이스바를 누릅니다.
2. 제공된 ImageJ용 Count-On-It: Gridiron 플러그인을 사용하여 플레이트의 콜로니를 열거합니다.
   1. Gridiron> Count-On-It을 실행합니다. Croptacular와 동일한 그리드 설정을 사용합니다. 사용자는 전체 폴더를 일괄 처리하거나, 단일 이미지를 분석하거나, 현재 이미지에서 시작할 수 있습니다.
   2. 상한 및 하한 픽셀 강도 값을 기준으로 임계값을 설정합니다. 모든 콜로니를 선택하면서 임계값을 가능한 한 엄격하게 만드십시오. 이상적으로는 선택한 콜로니 사이에 약간의 공간이 있지만 소프트웨어는 블롭을 어느 정도 분할할 수 있습니다. 임계값이 만족스러우면 "작업 필요" 대화 상자에서 확인 을 클릭합니다.
   3. 결과를 검사하려면 확대하여 군집 수를 더 자세히 살펴보십시오. 취소를 클릭하면 플러그인이 중단됩니다. 확인 을 클릭하여 계속합니다.
   4. 첫 번째 이미지에서 최소 콜로니 크기를 변경하기 위해 진행하거나 설정 메뉴로 돌아갈 수 있는 옵션이 제공되는지 확인합니다. 일괄 처리를 진행하려면 확인을 클릭합니다. 그런 다음 영수증 및 결과 테이블을 보관할 폴더를 선택합니다. "영수증" 폴더를 사용하거나 새 폴더를 만듭니다.
   5. 첫 번째 이미지 이후에는 다음 이미지가 이전 설정과 동일한 임계값으로 기본 설정됩니다. 확인 을 클릭하여 이러한 설정을 사용하거나 설정을 조정합니다. 사진이 일관되고 설정이 정확하면 "작업 필요" 대화 상자에서 확인 을 클릭합니다.
      참고: 배치의 모든 이미지가 완료되면 결과 테이블이 영수증과 동일한 폴더에 자동으로 저장됩니다.
   6. 소프트웨어에서 생성된 계수 영수증을 검토하고 계수 오류를 수동으로 수정합니다. ImageJ 플러그인은 통계적으로 정확하지만 오류가 발생합니다. 영수증을 증명하여 이상값을 검사하고 잘못된 계산을 식별합니다. 소프트웨어는 CFU 데이터를 영수증과 동일한 폴더에 .csv 파일로 저장합니다.
3. 사용자가 선호하는 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.

결과

그림 1: 식민지 형성 분석은 96웰 플레이트 형식을 사용하여 수백 마리의 개별 파리에서 CFU를 측정합니다. (A) 프로토콜 섹션에 설명된 대로 사용되는 식민지 분석 및 고처리량 정량화 방법에 대한 그림 개요. (B) 집락화 분석 후 파리의 Lactiplantibacillus plantarum (Lp) 풍부도는 고처리량 CFU 정량화 방법을 사용...

재료