금속 반응성 유전자의 역할을 연구하기 위한 금속 제한 박테리아 성장 분석

초록

출처: Maurakis, S., et al. 금속 반응성 유전자의 특성화 및 숙주 리간드로부터의 금속 획득을 위한 Neisseria gonorrhoeae의 금속 제한 성장. J. Vis. 경험. (2020).

이 비디오는 금속 반응 유전자의 역할을 연구하기 위한 금속 제한 박테리아 성장 분석을 보여줍니다. 금속 고갈 배지에서 성장한 야생형 및 돌연변이 박테리아는 금속 리간드와 함께 배양되고 플레이트 리더를 사용하여 성장을 모니터링합니다. 금속이 고갈된 조건에서 야생형 박테리아는 금속 흡수와 성장을 가능하게 하는 표면 수용체를 발현하는 반면, 돌연변이체는 이 수용체가 부족하여 성장이 제한됩니다.

프로토콜

1. Chelex 처리 CDM(Defined Medium) 원액의 제조

1. 원액 I
   1. 염화나트륨 또는 NaCl(233.8g), 황산칼륨 또는 K₂SO₄ (40.0g), 염화암모늄 또는 NH₄Cl(8.8g), 인산수소이칼륨 또는 K₂HPO₄ (13.9g) 및 인산이수소일칼륨 또는 KH₂PO₄ (10.9g)를 탈이온수에 최종 부피 1L로 혼합합니다.
   2. 용액을 여과 멸균하고 50mL 원추형 튜브에 분취합니다.
   3. -20°C에서 보관하십시오.
2. 원액 II
   1. 티아민 염산 또는 HCl(0.2g), 티아민 피로인산염-Cl(0.05g), 판토텐산칼슘(0.19g) 및 비오틴(0.3g)을 50%(vol/vol) 에탄올에 혼합하여 최종 부피 1L로 만듭니다.
   2. 50mL 원뿔형 튜브에 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
3. 원액 III
   1. L-아스파르테이트(4.0 g), L-글루타메이트(10.4 g), L-아르기닌(1.2 g), 글리신(0.2 g), L-세린(0.4 g), L-류신(0.72 g), L-이소류신(0.24 g), L-발린(0.48 g), L-티로신(0.56 g), L-프롤린(0.4 g), L-트립토판(0.64 g), L-트레오닌(0.4 g), L-페닐알라닌(0.2 g), L-아스파라긴-H₂O(0.2 g), L-글루타민(0.4 g), L-히스티딘-HCl(0.2 g), L-메티오닌(0.12 g), L-알라닌(0.8 g), L-라이신(0.4g) 및 환원형 글루타티온(0.36g)을 500mL 탈이온수에 함유했습니다.
   2. L-시스테인(0.44g)과 L-시스틴(0.28g)을 1M HCl의 최소 부피(~1mL)에 용해시키고 상기 아미노산 용액에 첨가한다.
   3. 모든 미립자 물질이 용해될 때까지 10N 수산화나트륨(NaOH)으로 용액의 pH를 조정합니다. 최종 pH는 10.0–11.0입니다.
   4. 탈이온수로 최종 부피를 1L로 만듭니다.
   5. 용액을 여과-멸균하고 250mL 용량으로 분취합니다.
   6. -20°C에서 보관하십시오.
4. 원액 IV
   1. 포도당(200g)을 탈이온수에 용해시켜 최종 부피 1L가 됩니다.
      참고: 포도당을 용해시키기 위해 용액을 가열해야 할 수도 있습니다.
   2. 용액을 여과 멸균하고 50mL 원뿔형 튜브에 분취합니다.
   3. -20°C에서 보관하십시오.
5. 원액 V
   1. 하이포잔틴(5.0g), 우라실(5.0g) 및 NaOH(4.0g)를 탈이온수에 혼합하여 최종 부피 1L가 되도록 합니다.
   2. 여과, 멸균 및 분취하여 50mL 원뿔형 튜브에 분취합니다.
   3. -20°C에서 보관하십시오.
6. 솔루션 VI
   1. 탈이온수에 1M 염화칼슘 이수화물 또는 CaCl_{2-2H 2O}(147g/L) 용액을 준비합니다. 필터, 멸균 및 실온(RT)에서 보관하십시오.
7. 원액 VII
   1. 탈이온수에 1M 무수 황산마그네슘(MgSO₄) 용액을 준비합니다. 필터, 멸균 후 RT에서 보관하십시오.
8. 원액 VIII
   1. 탈이온수에 1M 중탄산나트륨(NaHCO₃) 용액을 준비합니다. 필터, 멸균 후 RT에서 보관하십시오.

2. 4x 멸균 농축액 및 1x CDM 준비

알림: 이 절차는 금속이 용액으로 침출되는 것을 방지하기 위해 산성 처리된 멸균 유리 제품 또는 플라스틱에서 수행되어야 합니다.

1. 원액 I(50mL), II(20mL), III(250mL), IV(50mL) 및 V(20mL)를 20.0g의 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)과 혼합하고 저어줍니다.
2. pH를 7.4로 조정한 다음 탈이온수로 최종 부피를 500mL로 만듭니다.
3. Chelex-100 레진을 탈이온수 1L에 세척하여 방부제를 제거한 후 4x 멸균 농축액에 첨가합니다. 탈이온수 1L에 수지 50g을 넣고 최소 1시간 동안 저어줍니다. 진공 여과로 물을 제거하고 이 세척된 수지를 2.4단계에 사용합니다.
4. 수지 50g을 넣고 정확히 90분 동안 천천히 저어줍니다.
5. 필터 멸균을 통해 수지를 제거하고 4x 멸균 농축액을 4°C에서 보관합니다.
6. 1x 작업 농도의 CDM을 준비하려면 먼저 멸균 탈이온수로 4x 농축액을 희석한 다음 용액 VI(1x 용액 500mL당 125μL), 용액 VII(500mL당 535μL) 및 용액 VIII(500mL당 10mL)를 추가합니다.
   참고: 모든 원액이 이미 멸균되었지만 준비 후 1x 용액을 다시 여과 멸균하는 것이 좋습니다.

3. CDM 플레이트 준비

참고: 아래 레시피는 접시용 배지 1L를 만들지만 더 적은 양으로 준비하는 것이 가장 좋습니다. 모든 것이 비례적으로 축소됩니다.

1. 세척된 아가로스
   1. 아가로스 50g을 탈이온수 1L에 녹이고 1시간 동안 저어줍니다.
   2. 용액을 원심분리기 병으로 옮기고 RT에서 15분 동안 1,200 x g 으로 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 붓고 버립니다.
   3. 탈이온수를 충분히 첨가하여 아가로스 펠릿을 재현탁시킨 다음 1L 플라스크로 옮깁니다. 탈이온수로 최종 부피를 1L로 만든 다음 3.1.2단계와 같이 저어주고 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.
   4. 펠릿을 재현탁할 수 있도록 충분한 100% 에탄올을 첨가한 다음 새 1L 플라스크로 옮깁니다. 에탄올과 함께 최종 부피를 1L로 만듭니다. 3.1.2단계와 같이 저어주고 원심분리합니다.
   5. 3.1.4단계를 반복합니다.
   6. 아가로스 펠릿에 메탄올을 첨가하여 재현탁시킨 다음 1L 플라스크로 옮깁니다. 메탄올과 함께 최종 부피 1L로 만듭니다. 3.1.2단계와 같이 저어주고 원심분리합니다.
   7. 3.1.6단계를 반복합니다.
   8. 세척된 아가로스를 알루미늄 호일이 깐 트레이에 옮기고 흄 후드에서 건조시킵니다. 건조되면 장기간 보관을 위해 금속이 없는 용기에 옮깁니다.
2. 세척된 아가로스 10g과 감자 전분 5g을 탈이온수 750mL에 첨가합니다.
3. 대기압보다 100kPa 높은 121°C에서 30분 동안 오토클레이브합니다.
4. 배지를 ~65°C로 식힌 다음 250mL의 4X CDM, 250μL의 용액 VI, 1.07mL의 용액 VII 및 20mL의 용액 VIII를 첨가합니다.
5. 원하는 경우 접시를 붓기 전에 선택한 금속을 추가하십시오. 금속이 없는 상태를 유지하기 위해 킬레이트제를 추가할 필요는 없습니다.
6. 페트리 접시에 붓고 굳히십시오.

4. Neisseria gonorrhoeae의 금속 제한 성장

참고: 대부분의 응용 분야에서는 CDM을 접종하기 전에 박테리아에 금속 스트레스를 가할 필요가 없습니다. CDM의 초기 배가 단계와 후속 희석은 내부 철 및 아연 저장의 임균을 고갈시키기에 충분합니다. 이와 같이, 다음 절차의 처음 두 단계는 Kellogg's 보충제 I 및 12.5μM 질산철(Fe(NO₃)₃)이 보충된 Gonococcus(GC) 배지 베이스로 만든 한천 플레이트를 사용하여 수행됩니다. 초기 금속 응력이 필요한 경우 아연 킬레이트화를 위해 Fe(_{NO 3})₃ 가 없고 5 μM TPEN(N,N,N',N'-테트라키스(2-피리딜메틸) 에틸렌디아민) 또는 철 킬레이트화를 위해 10μM 데페록사민을 사용하여 GC 배지 베이스 플레이트를 준비하는 것이 좋습니다. 모든 배양은 5%_CO2로 37°C에서 수행됩니다.

1. 실험 이틀 전인 -2일에 냉동고 재고에서 임균을 GC 배지 플레이트에 줄무늬로 만들고 24시간 이상 배양하지 않습니다.
2. -1일째에 단일 콜로니를 신선한 GC 배지 플레이트에 줄무늬로 만듭니다. 성장 실험 14-16시간 전에 이 작업을 수행해 보십시오.
3. 실험 당일, 산세척된 125mL 배플 사이드암 플라스크에 5-10mL 1x CDM을 첨가하고 이를 사용하여 Klett 색도계를 블랭킹합니다.
4. 멸균된 면봉을 사용하여 건강한 단일 콜로니에서 CDM을 접종합니다. 20 Klett 유닛을 목표로 하십시오.
   참고: Klett 색도계를 사용할 수 없는 경우 분광 광도계도 적합합니다. Klett 단위를 OD로 변환하는 보편적인 변환 공식은 없지만 대략적인 가이드를 사용할 수 있습니다(https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
5. 약 1 질량 두 배가 될 때까지 250rpm에서 흔들면서 배양합니다 (40 Klett 단위). 이 작업은 1-2시간 정도 소요됩니다.
6. 이 시점에서, 배양은 초기 배양 밀도의 절반에 도달하기 위해 충분한 부피의 CDM을 첨가하여 다시 희석되고(예를 들어, 5mL의 배양이 20 Klett 단위에서 40 Klett 단위로 증가한 경우, 15mL의 CDM은 10 Klett 단위로 다시 낮아짐), 성장은 단계 4.5에서와 같이 계속됩니다. 역희석, 금속 처리 등의 구체적인 양은 다운스트림 응용 분야에 따라 다릅니다. 아래에 세 가지 예를 들었습니다

5. 금속 제한 성장 분석

참고: 이 분석은 미리 만들어진 성장 프리믹스를 설명합니다. 이러한 혼합물의 준비는 섹션 6에 설명되어 있습니다.

1. 4.5단계에서 질량을 배가하는 동안 96웰 마이크로플레이트의 웰을 10x 프리믹스로 전처리합니다. 또한 공백 역할을 할 세 개의 우물을 지정합니다. 이 웰에 10 μL의 10x 프리믹스와 90 μL의 CDM을 추가합니다.
2. 사이드암 플라스크의 배양액이 두 배가 되면 마이크로플레이트의 사용하지 않는 웰에 각 배양액 100μL를 추가하고 600nm(OD600)에서 광학 밀도를 측정합니다. 이것은 분광 광도계의 큐벳으로 수행할 수 있지만 분석 내에서 균주 수가 많으면 번거로울 수 있으며 분광 광도계가 사이드 암 플라스크의 암에서 직접 측정할 수 없는 한 일반적으로 권장되지 않습니다.
   1. OD를 측정하는 동안 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣어 임균이 생존 가능한 상태를 유지하는지 확인합니다.
3. 배양액을 OD600 = 0.02로 만드는 데 필요한 정확한 희석량을 계산합니다. 10x 프리믹스는 OD에 미치는 영향은 무시할 수 있으며 계산에서 생략할 수 있습니다.
4. 작은 배양 튜브에서 CDM으로 배양액을 희석하고 플레이트에서 10x 프리믹스를 1x로 희석할 수 있을 만큼 충분한 부피를 추가합니다. 플레이트 워머를 사용할 수 있는 경우 작업하는 동안 플레이트를 37°C로 유지하십시오.
5. 플레이트 리더기에서 흔들면서 플레이트를 8-12시간 동안 배양하고 원하는 간격으로 OD600 측정을 수행합니다.

6. 트랜스페린, S100A7, 칼프로텍틴의 금속 로딩 및 10x 프리믹스 제조

참고: CDM 준비와 마찬가지로 용액 준비에는 산성 세척 유리 또는 플라스틱을 사용하십시오.

1. 초기 완충액(100mM Tris, 150mM NaCl, 20mM NaHCO₃, pH = 8.4)에 10mg/mL(125μM)로 인간 트랜스페린을 용해시킵니다. S100A7 및 칼프로텍틴은 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-메르캅토에탄올 및 1 mM 염화칼슘 또는 CaCl₂, pH = 8.0으로 구성된 완충액에 현탁됩니다.
   1. 철 포화도 30%를 달성하기 위해 트랜스페린 용액(100 mM 구연산나트륨, 100 mM NaHCO₃, 5 mM 염화철(III) 육수화물 또는 FeCl_{3-6H 2}O, pH = 8.4)을 트랜스페린 용액에 첨가합니다(예를 들어, 75 μL의 페레이션 용액은 10 mg/mL로 만든 경우 5 mL의 트랜스페린에 적합함).
   2. 황산아연(ZnSO₄)을 S100A7 또는 칼프로텍틴에 50% 몰비로 첨가하여 25% 포화도를 생성합니다(각 단백질 분자에는 두 개의 금속 결합 부위가 있음). 100μM S100A7 또는 50μM ZnSO₄ 가 포함된 칼프로텍틴의 제제를 사용할 수 있습니다.
   3. 두 경우 모두 금속 로딩을 위해 최소 1시간 동안 엔드 오버 엔드 혼합을 허용합니다.
2. 투석 완충액 4L(40mM Tris, 150mM NaCl, 20mM NaHCO₃, pH = 7.4)를 준비합니다. 이것을 두 개의 별도 2L 용량으로 나누고 하나는 4°C에 놓습니다.
3. 주사기를 사용하여 금속 부하 단백질을 투석 카세트에 추가하고 RT에서 4시간 동안 첫 번째 완충액 부피에 대해 투석합니다.
4. 카세트를 두 번째 완충액 부피로 옮기고 4°C에서 밤새 투석합니다. 이 단계를 거친 후에는 결합되지 않은 금속을 제거해야 합니다.
   참고: 투석 후 단백질 농도를 결정하기 위해 비신코닌산 분석을 권장합니다.
5. 트랜스페린 활용을 위해 10x 트랜스페린 프리믹스를 유일한 철 공급원으로 사용하십시오.
   1. 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 30% 인간 Fe-트랜스페린 및 소 아포-트랜스페린 (철 로딩 단계 없이 인간 트랜스페린에 대해 설명된 대로 125μM에서 제조됨)을 각각 75μM 및 30μM로 희석하여 이 프리믹스를 준비합니다. 양성 대조군 프리믹스는 30% Fe-트랜스페린을 75μM Fe(NO)₃로 대체하고, 음성 대조군 프리믹스는 추가된 철을 생략하여 소 아포-트랜스페린만 유지합니다. 성장 분석에서 이러한 농축액 10μL를 배양액 90μL로 희석합니다. 최종 농도는 7.5μM, 30% 인간 Fe-트랜스페린 및 3μM 소 아포-트랜스페린입니다.
6. S100A7 또는 칼프로텍틴 사용을 위해 변형된 버전의 트랜스페린 7x 프리믹스를 유일한 아연 공급원으로 사용하십시오.
   1. 양성 대조군 프리믹스의 경우 50μM ZnSO₄ 를 트랜스페린 프리믹스에 통합합니다. 음성 대조군의 경우 50μM TPEN을 통합하고 아연을 생략합니다. 그런 다음 필요한 모든 샘플 웰에 대해 각각 10μL를 섭취하고 해당 부피를 새 튜브로 옮깁니다. 여기에 절반의 양의 멸균 PBS를 추가합니다. 예를 들어, 10개의 웰이 양성 대조군 프리믹스를 받는 경우 100μL의 프리믹스를 가져와 새 튜브로 옮기고 50μL의 PBS를 추가합니다. 음성 대조군에 대해서도 동일한 작업을 수행합니다.
   2. S100A7 또는 칼프로텍틴 프리믹스를 만들려면 필요한 웰당 10μL의 음성 대조군 프리믹스를 가져다가 새 튜브로 옮기고 그 부피의 절반을 25% Zn-S100A7 또는 칼프로텍틴을 추가합니다. 성장 분석에서 15μL의 프리믹스를 사용하고 85μL의 배양액으로 희석합니다. 트랜스페린의 최종 농도는 5μM의 Zn, TPEN 또는 S100A7/칼프로텍틴을 첨가하여 단계 8.5에서와 동일하게 유지됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
125 mL 보조 플라스크	벨코	2578-S0030	맞춤 주문해야 합니다.
2-메르캅토에탄올	VWR	M131	연기 후드에서 열림
3MM 용지	GE 헬스	3030-6461	텍스트에서 "여과지"라고 합니다.
아가로스	바이오론	바이오-41025	가루
염화암모늄	시그마-알드리치	A9434	가루
소 트랜스페린	시그마-알드리치	T1428	가루
염화칼슘 이수화물	시그마-알드리치	C5080	가루
판토텐산칼슘	시그마-알드리치	C8731	가루
칼프로텍틴	해당 사항 없음	해당 사항 없음	우리는 협력자로부터 이것을 공급받습니다
Chelex-100 수지	바이오 래드	142-2832	사용하기 전에 탈이온수로 씻으십시오.
면봉 끝 멸균 면봉	청교도	25-806	면은 이 용도에 폴리에스터보다 낫습니다.
데페록사민	시그마-알드리치	디9533	가루
D-포도당	시그마-알드리치	G8270	가루
투석 카세트	열	66380	사용하기 전에 완충액에 미리 담그십시오.
에탄올	콥텍	V1016	가연성 액체, 가연성 캐비닛에 보관
염화제이철	시그마-알드리치	F7134	자극성, 흡입하지 마십시오.
질산제이철 비수화물	시그마-알드리치	에프1143	자극성, 흡입하지 마십시오.
GC 미디엄 베이스	디프코	228950	분말, 이미 한천 함유
글리신	시그마-알드리치	지8898	가루
헴스	어부	L-15694	가루
인간 트랜스페린	시그마-알드리치	T2030 시리즈	가루
하이포크산틴	시그마-알드리치	H9377	가루
클렛 색도계	마노스타트	37012-0000	배양 밀도를 평가하기 위해 색상 투과율을 사용합니다.
L-알라닌	시그마-알드리치	A7627	가루
L-아르기닌	시그마-알드리치	A5006	가루
L-아스파라긴 일수화물	시그마-알드리치	A8381	가루
L-아스파르테이트	시그마-알드리치	A9256	가루
L-시스테인 염산염	시그마-알드리치	C1276	가루
L-시스틴	시그마-알드리치	C8755	가루
L-글루타메이트	시그마-알드리치	지1251	가루
L-글루타민	시그마-알드리치	지3126	가루
L-히스티딘 모노하이드로클로라이드	시그마-알드리치	H8125	가루
L-이소류신	시그마-알드리치	I2752	가루
L-류신	시그마-알드리치	L8000	가루
L-라이신	시그마-알드리치	L5501 시리즈	가루
L-메티오닌	시그마-알드리치	M9625	가루
L-페닐알라닌	시그마-알드리치	P2126	가루
L-프롤린	시그마-알드리치	P0380	가루
L-세린	시그마-알드리치	S4500 시리즈	가루
L-트레오닌	시그마-알드리치	T8625	가루
L-트립토판	시그마-알드리치	티0254	가루
L-티로신	시그마-알드리치	T3754	가루
L-발린	시그마-알드리치	V0500	가루
황산마그네슘	시그마-알드리치	M7506	가루
메탄올	VWR	BDH1135-4LP	가연성 액체, 가연성 캐비닛에 보관
인산이염기성 칼륨	시그마-알드리치	60356	가루
인산칼륨 일염기성	시그마-알드리치	P9791	가루
황산칼륨	시그마-알드리치	P0772	가루
감자 전분	시그마-알드리치	S4251	가루
글루타티온 감소	시그마-알드리치	지4251	조심스럽게 다루십시오. 쉽게 산화될 수 있습니다.
S100A7 시리즈	해당 사항 없음	해당 사항 없음	우리는 협력자로부터 이것을 공급받습니다
중탄산나트륨	시그마-알드리치	S5761	가루
소금	VWR	470302	가루
구연산나트륨	어부	에스279	가루
수산화나트륨	아크로스 오가닉스	383040010	높은 흡습성
티아민 염산염	시그마-알드리치	T4625	가루
티아민 피로인산염	시그마-알드리치	C8754	코카르복실라아제라고도 함
티펜	시그마-알드리치	P4413	가루
트리스	VWR	497	가루
우라실	시그마-알드리치	U0750	가루
아연 황산 칠수화물	시그마-알드리치	204986	자극성, 흡입하지 마십시오.