Dot Blot을 사용한 Neisseria gonorrhoeae의 표면 금속 수송체 검출

초록

출처: Maurakis, S. 및 Cornelissen, CN 금속 반응성 유전자의 특성화 및 숙주 리간드로부터의 금속 획득을 위한 Neisseria gonorrhoeae의 금속 제한 성장. J. Vis. 경험. (2020년)

이 비디오는 리간드 결합, 항체 검출 및 비색 시각화를 포함하는 도트 블롯 분석을 사용하여 금속 제한 조건에서 성장한 임 균에서 표면 금속 수송체를 검출하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 외막 금속 수송체에 의한 리간드 결합 검출

1. 3부피의 CDM(chelex 처리 정의 배지)으로 배양물을 역희석합니다.
2. 그런 다음 4시간 동안 흔들면서 배양합니다.
3. 4시간 표시 직전에 여과지 3장과 니트로셀룰로오스 1장을 도트 블롯 장치에 맞는 대략적인 크기로 자릅니다. 니트로셀룰로오스를 탈이온수에 미리 담근 다음 니트로셀룰로오스 아래에 여과지로 장치를 조립합니다.
4. 4시간에 세포 밀도를 기록하고 적절한 최종 밀도로 표준화합니다.
5. 세포 배양액을 니트로셀룰로오스에 피펫팅하고 여과지가 모든 액체를 흡수할 수 있도록 충분한 시간을 허용합니다.
6. 장치를 분해하고 블롯을 건조시킨 다음 트리스 완충 식염수의 5% 소 혈청 알부민 또는 탈지 우유(w/v)에서 1시간 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인을 차단합니다.
7. 도트 블롯 장치를 재조립하고 여과지를 파라핀 필름으로 교체하여 니트로셀룰로오스 아래에 누출 방지 밀봉을 만듭니다.
8. 관심 있는 금속 결합 리간드를 차단제 및 프로브 세포에서 1시간 동안 0.2μM로 희석합니다.
9. 진공으로 액체를 빨아들이고 블롯을 세척한 다음 표준 면역학적 절차에 따라 신호를 개발합니다. 세척 단계는 장치 내부 또는 외부에서 수행될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
125 mL 보조 플라스크	벨코	2578-S0030	맞춤 주문해야 합니다.
2-메르캅토에탄올	VWR	M131	연기 후드에서 열림
3MM 용지	GE 헬스	3030-6461	텍스트에서 "여과지"라고 합니다.
블로팅 등급 차단제	바이오 래드	170-6404	탈지 분유
소 혈청 알부민	로슈	3116964001	가루
칼프로텍틴	해당 사항 없음	해당 사항 없음	우리는 협력자로부터 이것을 공급받습니다
Chelex-100 수지	바이오 래드	142-2832	사용하기 전에 탈이온수로 씻으십시오.
면봉 끝 멸균 면봉	청교도	25-806	면은 이 용도에 폴리에스터보다 낫습니다.
도트 블롯 장치	슐라이허 & 슈웰	10484138	샘플 로딩 전에 뚜껑을 최대한 단단히 잠그십시오.
에탄올	콥텍	V1016	가연성 액체, 가연성 캐비닛에 보관
클렛 색도계	마노스타트	37012-0000	배양 밀도를 평가하기 위해 색상 투과율을 사용합니다.
메탄올	VWR	BDH1135-4LP	가연성 액체, 가연성 캐비닛에 보관
니트로셀룰로오스	GE 헬스	10600002	사용할 때까지 보호복에 보관하십시오.
S100A7 시리즈	해당 사항 없음	해당 사항 없음	우리는 협력자로부터 이것을 공급받습니다
소금	VWR	470302	가루
트리스	VWR	497	가루