GFP/Luciferase Reporter System을 사용한 Mycobacterium smegmatis 오번역률 측정

초록

출처: Chen, Y., et al., 기능 획득 리포터 시스템을 사용한 특정 마이코박테리아 오번역률 측정. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 유도성 GFP 및 분비된 돌연변이 루시페라제 리포터 시스템을 사용하여 마이코박테리움 스메그마티스 에서 오번역을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 오번역으로 인한 발광을 측정하고 GFP 형광과 비교하여 테스트 분자가 번역 정확도에 미치는 영향을 평가하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 나노룩 루시페라아제(Nluc)/녹색 형광 단백질(GFP) 리포터

메모: 이 방법의 시각적 표현은 그림 1을 참조하십시오.

1. -80°C 스톡에서 박테리아 리포터 균주에 2mL의 7H9 배지를 접종합니다. OD₆₀₀ 이 고정상(OD >3)에 도달할 때까지 37°C에서 1-2일 동안 흔듭니다.
2. 50mL의 7H9 배지로 계代배양하고 OD₆₀₀ 이 후기 고정기에 도달할 때까지 성장시킵니다(>4).
3. 박테리아를 96웰 플레이트에 분취하기 전에 최종 농도 50ng/mL의 안하이드로테트라사이클린(ATC)을 첨가하고 잘 혼합합니다. 벌크 배양의 유도는 모든 웰에 동일한 양의 유도제가 포함되고 리포터의 유도가 동기화되도록 합니다. 박테리아를 투명하고 바닥이 둥근 96웰 플레이트에 분취하고 각 웰에 100μL의 부피를 넣습니다.
4. 오번역률에 영향을 미치는 작은 분자를 스크리닝하려면 표시된 농도로 화합물을 첨가하여 웰을 선택합니다. 이 프로토콜의 목적을 위해 kasugamycin( 그림 2에 표시된 용량)을 예시로 사용합니다. 웰을 선택하기 위해 서로 다른 용량의 카스가마이신을 추가합니다(각 실험 그룹에는 적어도 2개의 생물학적 복제가 포함되어야 함).
5. 샘플을 37°C에서 16-20시간 동안 흔들고 유도합니다.
   메모: 플레이트를 필름으로 밀봉해야 합니다. 또한 테스트 웰에서 증발을 제한하기 위해 모든 가장자리 웰을 최소 200μL의 멸균수로 채워야 합니다.
6. 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 80μL를 채취하고 샘플을 검은색 96웰 플레이트로 옮깁니다(형광 신호 측정을 최대화함). 적분 시간으로 20ms의 발광계로 GFP 신호를 측정합니다.
7. GFP 신호를 측정한 후 플레이트를 3,220 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액 50μL를 바닥이 흰색인 96웰 플레이트(발광 신호 측정을 최대화)에 옮기고, 각 웰에 50μL의 Nluc 기질을 첨가하고 잘 혼합한 다음 1,000ms를 통합 시간으로 발광계로 측정합니다.
8. 보정된 Nluc 발광 값을 GFP 형광으로 나누어 Nluc/GFP 비율을 결정합니다: 이 측정값(임의의 단위)은 아스파라긴 오번역에 대한 아스파르테이트의 상대적 측정값입니다.

결과

그림 1: 오번역률 Nluc-GFP 리포터 측정 개요. Nluc 및 GFP 리포터로 형질전환된 M. smegmatis의 신선한 배양액은 테스트할 모든 플레이트에 충분한 부피로 성장됩니다(~10mL/96웰 플레이트 가정). 박테리아 배양물을 각 웰에 피펫팅하기 직전에, 벌크 배양에 ATC를 첨가하여 리포터의 발현을 유도합니다. 우물을 밤새 흔들어 배양합니다. 상대적 오번역률을 측정하려면 배양액을 검은색 플레이트로 옮기고(형...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
미들브룩 7H9	BD 디프코	271310
안하이드로테트라사이클린	케이맨 케미칼	10009542
카스가마이신	시그마	K4013
Nano-Glo 루시페라아제 분석	프로메가	N1120
Fluoroskan Ascent FL 발광계	열	/
Assay Plate, 96 웰 화이트, 평평한 바닥 높은 결합, 뚜껑 없음	코스타	3922
Assay Plate, 96 웰 블랙, 플랫 바닥 하이 비딩, 뚜껑 없음	코스타	3925
96웰 세포 배양 클러스터, 뚜껑이 있는 평평한 바닥	코스타	3599
pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N	NA	NA	돌연변이 Nluc 루시페라아제의 테트라사이클린 유도 분비 가능 버전을 갖는 에피소솜 셔틀 플라스미드
pMC1S-GFP	NA	NA	GFP의 테트라사이클린 유도 발현을 위한 마이코박테리아 통합(L5 부위) 벡터