무세포 시스템을 이용한 나노디스크 안정화 막 단백질 항원 합성

초록

출처: Gilmore, SF, et al. 백신 개발을 위한 Chlamydia muridarum 의 재조합 주요 외막 단백질에 대한 무세포 규모 생산 및 보조제 추가. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 이중 구획 시스템을 사용하여 나노디스크 안정화 막 단백질 항원의 무세포 합성을 보여줍니다. 이 장치는 효율적인 단백질 합성, 적절한 접힘 및 나노디스크로의 안정적인 통합을 위한 최적의 조건을 유지합니다.

프로토콜

서브유닛 백신 제형을 위한 주요 외막 단백질-텔로덴드리머 나노지단백질 입자(MOMP-tNLP)의 무세포 생산

1. 무세포 방법을 사용하여 MOMP-tNLP를 준비합니다.
   1. 무세포 반응을 설정하기 2시간 전에 원핵생물 무세포 단백질 발현 키트를 열고 재구성 완충액 중 하나를 해동합니다. 해동 후 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 없는 프로테아제 억제제 칵테일 1정을 넣고 완전히 녹입니다.

2. 5 x 1 mL 반응을 실행하도록 설계된 키트를 사용하여 이 프로토콜을 따릅니다.

   메모: 일반적인 스케일 업 생산은 3 x 1 mL입니다.

   1. 각 1mL 반응에 대해 525μL의 재구성 완충액을 대 장균 용해물 병에 넣고 부드럽게 굴려 용해시킵니다. 반응 첨가제(예: 아데노신 삼인산, 구아노신 삼인산)가 들어 있는 병에 재구성 완충액 250μL를 넣고 부드럽게 굴려 용해시킵니다.
   2. 반응 공급 병에 8.1mL의 재구성 완충액을 넣고 고무 마개로 다시 캡을 씌운 다음(고무 마개 내부에 닿지 않도록 주의) 부드럽게 뒤집거나 굴려 용해시킵니다.
   3. 아미노산 혼합물 병에 재구성 완충액 3mL를 넣고 고무 마개로 다시 캡핑한 다음 부드럽게 반전/롤링하여 용해시킵니다.
      메모: 고무 마개 내부를 만지면 오염될 수 있으므로 주의하십시오.
   4. 메티오닌 병에 재구성 완충액 1.8mL를 넣고 부드럽게 굴려 녹인 다음 사용할 때까지 얼음 위에 보관합니다.
       
3. 반응 용액을 준비합니다.
   1. 대 장균 용해물 병에 재구성된 반응 혼합물 225 μL, 메티오닌이 없는 재구성된 아미노산 혼합물 270 μL, 재구성된 메티오닌 30 μL를 추가합니다. 또한 400μL의 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)/텔로덴드리머 혼합물, 15μg의 MOMP 플라스미드 및 0.6μg의 Δ49아포지단백A1 플라스미드를 첨가합니다. 굴리거나 부드럽게 흔들어 섞습니다.
      메모: 두 플라스미드가 동일한 플라스미드 백본으로 구성되었는지 확인합니다. 소용돌이치지 마십시오.
   2. 총 용액 20μL를 취하여 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 대조군 반응을 위해 1.5mL 튜브에 따로 보관합니다(아래 참조).
       
4. 공급 용액을 준비합니다. 사료 혼합물 병에 메티오닌이 없는 재구성된 아미노산 혼합물 2.65mL와 재구성된 메티오닌 300μL를 추가합니다. 굴리거나 부드럽게 흔들어 녹입니다.
   메모: 이때 사용하지 않은 재구성 완충액과 메티오닌은 냉동실에 다시 넣어 보관할 수 있습니다.
    
5. 반응 용액 1mL를 무세포 반응 키트에 제공된 내부 반응 챔버로 옮기고 채워진 후 밀봉합니다. 공급 용액 10mL를 반응 용기의 외부 챔버로 옮기고 밀봉합니다.
   메모: 챔버를 너무 많이 채우지 마십시오! 내부 반응 챔버와 내부 공급 챔버의 상단에 기포가 있으면 반응에 부정적인 영향을 미칩니다. 남은 반응 용액은 1.5mL 튜브에 넣고 주 용기와 함께 혼합할 수 있습니다.
    
6. 0.5μL의 GFP 대조군 플라스미드(0.5mg/mL)를 이전에 분취한 20μL 반응 혼합물에 첨가합니다.
   메모: 많은 키트에는 품질 관리 목적으로 대조군 플라스미드가 함께 제공됩니다. T7 프로모터와 대장균 리보솜 결합 부위(RBS)를 가진 대부분의 GFP 발현 플라스미드도 대조군 플라스미드로 사용할 수 있습니다.
    
7. 반응을 300rpm, 30°C의 셰이커에 최대 18시간 동안 놓습니다. 반응이 성공적이었는지 확인하려면 UV 광원을 사용하여 배양 15분 후에 대조군 GFP (그림 1) 의 합성으로 인한 형광을 확인합니다.
   메모: 이러한 조건, 특히 온도는 다른 막 단백질의 발현을 위해 최적화되어야 할 수 있습니다.

결과

그림 1: MOMP-tNLP의 발현 및 정제. (A) GFP 플라스미드가 없는 용해물(왼쪽)과 비교하여 UV 광원(오른쪽)에서 발광하는 GFP 컨트롤을 성공적으로 발현한 무세포 반응의 작은 분취량을 포함하는 튜브의 이미지. (B) SDS-PAGE 후 SYPRO Ruby로 염색한 단백질 겔은 MOMP-tNLP의 정제 프로파일을 보여줍니다. MOMP는 40k...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
분말로 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)	Avanti 극성 지질	850345
1.5 mL 내독소 프리 원심분리기 튜브	에펜도르프	2600028
C24 인큐베이터 셰이커	뉴브런즈윅 사이언티픽
무세포 발현 시스템: RTS 500 ProteoMaster 대장균 HY 키트	생명공학토끼	BR1400201
cOmplete, EDTA가 없는 프로테아제 억제제 칵테일	Roche 분자 진단	4693132001
오비탈 셰이커
PEG5K-CA8 텔로덴드리머(맞춤형 합성 제품)
pIVEX2.4d 벡터	Roche 분자 진단
플라스미드 맥시 키트	키아겐	12162
UV 광원