박테리아 백신 항원의 구조적 무결성 평가를 위한 웨스턴 블롯

초록

출처: Gilmore, SF et al. 백신 개발을 위한 Chlamydia muridarum 의 재조합 주요 외막 단백질에 대한 무세포 규모 생산 및 보조제 추가. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 나노입자 기반 백신 복합체 내에서 주요 외막 단백질(MOMP)의 구조적 무결성을 평가하기 위해 웨스턴 블로팅을 사용하는 방법을 보여줍니다. 단백질 전달, 항체 라벨링 및 형광 이미징과 관련된 주요 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. 웨스턴 블롯

1. 웨스턴 블로팅의 경우 SDS-PAGE로 주요 외막 단백질(MOMP)-텔로덴드리머 나노지단백질 입자(tNLP)를 분리하고 제조업체의 프로토콜에 따라 표준 설정의 상업용 건식 블로팅 시스템을 사용하여 겔을 전사합니다.
   1. 전이가 완료된 후 스택에서 블롯을 제거하고 Δ49ApoA1 단백질의 His-태그에 대한 0.2% Tween 20 및 0.5 mg/mL 단클론 항체(MAb) 40 또는 0.2 mg/mL MAbHIS 항-His-태그 항체를 포함하는 적절한 차단 완충액에서 4°C에서 밤새 각 블롯을 배양합니다.
      메모: 블로팅에 사용되는 항체 희석액은 MAb40의 경우 1:1,000, MAbHIS 항체의 경우 1:500–1,000입니다.
   2. PBS-T(1x 인산염 완충 식염수(PBS), 0.2% Tween 20, pH 7.4)로 각 블롯을 5분 동안 3회 세척합니다.
   3. 형광단에 접합된 2차 항체(예: 적외선 염료(IRDye))를 포함하는 블로킹 완충액에서 1:10,000 희석으로 블롯을 1시간 동안 배양합니다.
   4. PBS-T로 5분 동안 3회 블롯을 다시 세척합니다. 형광 이미저를 사용하여 최종 세척 후 얼룩을 이미지화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
iBlot+2:22 드라이 블로팅 시스템	라이프 테크놀로지
iBlot 2 전사 스택, PVDF	라이프 테크놀로지	IB24001
Image Studio V2.0 소프트웨어	Li-COR 바이오사이언스
면역 블롯 PVDF 멤브레인	바이오 래드	1620177
LI-COR 오디세이 Fc 이미저	Li-COR 바이오사이언스
0.2% Tween 20을 함유한 TBS의 Odyssey 차단 완충액	Li-COR 바이오사이언스	927-50000
오비탈 셰이커
PBS-T(1x PBS, 0.2% 트윈 20, pH 7.4)
1차 항체: MAb40( C. muridarum MOMP의 가변 도메인 1(VD1)에 대한 단클론 항체
1차 항체: MAbHIS, Penta-His 항체	키아겐	34660
2차 항체: IRDye 800CW 염소(다클론) 항마우스 IgG(중량 및 경량)	Li-COR 바이오사이언스	926-32210