고전압 전기천공법을 이용한 박테리아의 제조 및 형질전환

Abstract

출처: Stefan, A., et al., 대장균에서 단백질 공동 발현의 다면적인 이점. J. Vis. 경험. (2015년)

이 비디오는 세포 준비, 전기천공, 회수 및 형질전환체 선택을 포함하여 항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드로 대장균 을 형질전환하는 절차를 보여줍니다.

Protocol

1. 대장균 공동 형질전환체의 분리

1. 형질전환할 적절한 대장균 균주의 전기 적극 세포를 준비합니다. 선택한 균주의 단일 콜로니인 Luria-Bertani(LB) 배지(트립톤, 효모 추출물, NaCl, 각각 10, 5 및 10g/L) 1ml에 옮기고 180rpm의 진탕 조건에서 37°C에서 배양합니다. 신선한 LB 배지 25ml에 사전 배양을 1:500으로 희석하고 배양액을 37°C에서 배양합니다.
2. 로그 단계(0.6 OD 또는 광학 밀도)에서 세포 현탁액을 5,000 x g에서 20분 동안 원심분리하고 원래 배양 부피의 절반에 있는 10%, v/v 얼음처럼 차가운 멸균 글리세롤-물에 펠릿을 재현탁합니다. 이 단계를 4회 반복하여 재현탁량을 절반으로 줄입니다. 마지막으로, 펠릿을 글리세롤/물에 재현탁하고 세포 현탁액을 50μl 분취량으로 나눕니다. 분취량을 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
3. 0.5mM EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)가 보충된 멸균수에 원하는 플라스미드를 용해시킵니다. 얼음 위에서 전기 적극 세포의 분취량을 해동하고 적절한 양(2.5-5ng)의 벡터와 혼합합니다. 혼합물을 전기천공에 적합한 0.1cm 큐벳에 분배하고 1.8kV를 적용합니다.
4. 전기천공된 세포를 SOC(이화산물 억제가 있는 초최적 국물) 배지 1ml(0.2% w/v 포도당, 10mM MgCl₂, 2.5mM KCl가 보충된 LB 배지)에 즉시 옮기고, 진압하면서 1시간 동안 배양하고, 마지막으로 100μl 분취량을 적절한 항생제와 함께 LB 한천이 포함된 페트리 접시로 옮깁니다. O/N을 37°C에서 배양합니다.
5. 페트리 접시에 단일 콜로니를 줄무늬로 만들어 변형자를 정화하십시오.

Materials