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1. 대장균 또는 대장균 공동 형질전환체의 분리
- 형질전환할 적절한 대장균 균주의 전기 적극 세포를 준비합니다. 선택한 균주의 단일 콜로니인 Luria-Bertani(LB) 배지(트립톤, 효모 추출물, 염화나트륨 또는 NaCl, 각각 10, 5 및 10g/L) 1ml에 옮기고 180rpm의 진탕 조건에서 37°C에서 배양합니다. 신선한 LB 배지 25ml에 사전 배양을 1:500으로 희석하고 배양액을 37°C에서 배양합니다.
- 로그상(0.6 OD)에서 세포 현탁액을 5,000 x g에서 20분 동안 원심분리하고 펠릿을 원래 배양 부피의 절반에 있는 10%, v/v 얼음처럼 차가운 멸균 글리세롤-물에 재현탁합니다. 이 단계를 4회 반복하여 매번 재현탁량을 절반으로 줄입니다. 마지막으로, 펠릿을 글리세롤/물에 재현탁하고 세포 현탁액을 50μl 분취량으로 나눕니다. 분취량을 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
- 0.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 보충된 멸균수에 원하는 플라스미드를 용해시킵니다. 전기 적극 세포의 분취량을 얼음 위에서 해동하고 적절한 양(2.5-5ng)의 벡터와 혼합합니다. 혼합물을 전기천공에 적합한 0.1cm 큐벳에 분배하고 1.8kV를 적용합니다.
- 전기천공된 세포를 이화작용물 억제(SOC) 배지(0.2% w/v 포도당, 10mM 염화마그네슘 또는 MgCl2, 2.5mM 염화칼륨 또는 KCl가 보충된 LB 배지)가 포함된 초최적 국물 1ml에 즉시 옮기고, 진흔하면서 1시간 동안 배양하고, 마지막으로 100μl 분취량을 적절한 항생제와 함께 LB 한천이 포함된 페트리 접시로 옮깁니다. 37°C에서 하룻밤(O/N)으로 배양합니다.
- 페트리 접시에 단일 콜로니를 줄무늬로 만들어 변형자를 정화하십시오.
- 1차 형질전환체의 전기 적극 세포를 준비하고 1.1 내지 1.5단계를 반복하여 추가 플라스미드로 형질전환합니다.
- 공동 형질전환체의 글리세롤 스톡을 준비합니다. 적절한 항생제가 보충된 LB에서 단일 콜로니를 옮기고, 쉐이킹 하에 37°C에서 배양하고, 로그상(0.6 O.D.)에서 세포 현탁액을 5,000 x g에서 20분 동안 원심분리합니다. 15% v/v 글리세롤을 함유한 LB 항생제 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 분취량으로 분배하고 – 80°C에서 보관합니다.
2. 대장균 DNA 중합효소 III의 야생형 ε 서브유닛과 돌연변이 유발 εD12A 변이체를 공동 발현하는 집단의 돌연변이 분석
- pBAD-ε 및 pGOOD1-εD12A 벡터를 포함하는 대장균 TOP10의 단일 콜로니를 1ml의 LB-항생제 배지로 옮깁니다. O/N을 37°C에서 배양합니다.
- 신선한 배지(10ml)가 들어 있는 3개의 플라스크에 사전 배양을 1:250으로 희석하고 적절한 유도제(아라비노스, 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 또는 아라비노스 및 IPTG, 각각 1mM)를 첨가하고 37°C에서 8시간 동안 배양합니다. 병렬로 유도되지 않은 배양균을 준비합니다.
- 1ml의 분취량을 수집한 다음 적절한 유도제가 보충되거나 보충되지 않은 신선한 배지(10ml)가 들어 있는 새 플라스크에 1:500으로 희석합니다. O/N을 37°C에서 배양합니다.
- 2.2단계와 2.3단계를 반복하고 1ml의 분취량을 수집합니다.
- 각 문화권에서 발생한 세대 수를 결정합니다. LB 플레이트에 접종물 및 배양물의 적절한 연속 희석액 100μl를 옮깁니다. O/N을 37°C에서 배양합니다. LB 플레이트의 콜로니를 계산하고 접종물(logI) 및 성장 종료 시 배양물(logC)에 존재하는 세포 수의 로그를 계산합니다. 세대 수를 결정하려면 (로그C– 로그I)/0.301 공식을 사용하십시오.
- 5,000 x g 에서 20분 동안 원심분리하고 세포를 50 mM 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 염산염(Tris-HCl), pH 7.6, 50 mM NaCl 1 ml에 재현탁합니다. 세포를 투과화하려면 클로로포름 2-3방울을 첨가하고 20초 동안 소용돌이치십시오.
- p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드(PNPGluc)를 기질로 사용하여 96웰 마이크로플레이트에서 각 분취량의 β-글루코시다아제 활성을 결정합니다. 각 웰에 투과화 세포 100μl와 기질 100μl(물 또는 H2O에 16mg/ml 원액)을 첨가합니다. 우물에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 마이크로플레이트 리더와 적절한 필터를 사용하여 420nm에서 흡광도를 판독합니다.