광합성 박테리아에서 Plastoglobules의 추출 및 정제

초록

출처: Shivaiah, K., et al. 식물 잎 조직 및 시아노박테리아에서 Plastoglobule 지질 방울 분리. J. Vis. 경험. (2022년)

비디오는 시아노박테리아에서 플라스토글로불을 분리하는 방법을 보여줍니다. 이는 시아노박테리아 배양으로 시작하여 기계적 힘을 사용하여 세포 파괴를 통해 진행됩니다. 광합성 색소의 방출은 성공적인 용해를 나타냅니다. 그런 다음 자당 단계 구배를 사용하여 밀도에 따라 세포 성분을 분리하여 저밀도 편성소구가 상단에 뚜렷한 밴드를 형성할 수 있도록 합니다. 이 분획은 추가 분석을 위해 수집 및 보존됩니다.

프로토콜

1. 조잡한 플라스토소블 분리

1. 시아노박테리아에서 조한 플라스토글로블 추출
   1. Synechocystis sp. PCC 6803의 50mL 배양액을 고정상(약 7-10일)으로 성장시키고 분광 광도계를 사용하여 세포 밀도를 750nm(OD₇₅₀)에서 2.0의 광학 밀도로 조정합니다. 배양 조건의 경우 BG-11 배지를 사용하고 인큐베이터에서 150μmol 광자/^m2/s, 2% CO₂, 32°C의 광도와 분당 150회전(rpm)으로 연속 흔들면서 성장시킵니다.
   2. 다당류를 제거하려면 50mL 배양액을 4°C에서 45분 동안 6,000× g에서 원심분리한 후 상청액을 제거하여 세포를 세척합니다. 50mL의 완충액 A에서 세포를 두 번 세척하여 계속합니다(표 1). 세포 균질액의 분취량을 제거하고 원심분리 전에 따로 보관하여 대표적인 총 세포 샘플로 보관합니다.
   3. 세척된 펠릿을 25mL의 완충액 A에 재현탁하고 1,100파운드/제곱인치(psi)의 프렌치 압력 셀을 사용하여 세포를 부수고, 백색광 하에서 용해된 색상이 녹색에서 빨간색-파란색-녹색으로 변할 때까지 3×(단백질 변성을 피하기 위해 각 주기 사이에 샘플을 얼음 위에 놓음)을 반복합니다. 예식된 셀을 사용하고 냉장실에서 이 단계를 수행합니다.
   4. 생성된 균질액을 각 튜브에 최대 2.5mL까지 채워진 8개의 3mL 초원심분리기 튜브 사이에 분배한 다음 400μL의 배지 R을 조심스럽게 오버레이하여 스텝 그래디언트를 생성합니다.
   5. 필요에 따라 배지 R을 추가하여 튜브의 균형을 조심스럽게 맞추고 4°C에서 150,000 × g에서 30분 동안 원심분리합니다. 틸라코이드 및 기타 더 무거운 소기관(폴리하이드록시알카노에이트 체 포함)은 펠릿화되는 반면, 플라스토소블은 자당 구배의 상단 또는 근처에서 노란색의 유성 패드로 쉽게 볼 수 있습니다(그림 1C).
   6. 주사기와 22G 바늘로 생성된 조한 플라스토글로피의 플로팅 패드를 수확하고 2mL 튜브에 침착시킵니다. 필요한 경우 바늘 끝으로 초원심분리기 튜브 벽 측면에서 성형소구를 긁어냅니다.
   7. 2.2단계를 계속 진행합니다. 또는 조한 플라스토글로불을 -80°C에서 보관하고 나중에 정제합니다.

표 1: 식물 잎 조직 또는 시아노박테리아로부터 플라스토글로블 분리를 위한 완충 레시피.

버퍼 컴포지션
분쇄 완충액	50 mM HEPES-KOH (pH 8.0)
	5 mM 염화마그네슘(MgCl2)
	100 mM 소르비톨
	5 mM 아스코르브산 b
	5 mM 환원 시스테인 b
	0.05 % (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA) b
미디엄 R	50 mM HEPES-KOH (pH 8.0)
	5 mM MgCl2
미디엄 R 0.2	50 mM HEPES-KOH (pH 8.0)
	5 mM MgCl2
	자당 0.2 M
미디엄 R 0.7	50 mM HEPES-KOH (pH 8.0)
	5 mM MgCl2
	자당 0.7 M
버퍼 A	25 mM HEPES-KOH (pH 7.8)
	250 mM 자당
a. 각 완충액 성분의 최종 농도가 제공됩니다.
b. 격리 당일 신선하게 추가해야 합니다. 완충액은 분리 전날에 준비할 수 있지만 특정 성분은 분리 당일에 신선하게 첨가해야 하며 포스파타제 및 프로테아제 억제제도 추가해야 합니다.

2. 순수한 질소구 수확

1. 시아노박테리아 가공
   1. 4개의 2.5mL 초원심분리기 튜브에서 자당 구배를 생성하고, 먼저 1.3단계의 조 플라스토소블 500μL를 750μL의 배지 R 0.7과 혼합한 다음 750μL의 배지 R 0.2와 오버레이합니다.
   2. 자당 구배를 150,000 × g에서 4°C에서 90분 동안 원심분리합니다. 자당 구배의 상단 상에서 주사기와 22G 바늘로 순수 장형소체(그림 1C)를 수집하고 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   3. 순수한 plastoglobules를 분취하고 액체 질소에서 급속 동결합니다. -80°C에서 직접 보관하거나 건조 분말로 동결건조하십시오.

결과

그림 1: 플라스토글로불 및 틸라코이드의 분리 및 면역블로팅. (A) 자당 구배에서 추출하기 전에 Z. mays 에서 정제된 대표적인 plastoglobule 샘플. (B) 자당 쿠션에서 추출하기 전에 건조된 E. nindensis 의 대표적인 조 플라스토글로블 샘플. (C) Synechocystis ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아스코르브산	BDH	BDH9242
소 혈청 알부민	프로리언트 생물학	68700
프렌치 압력 셀(모델 FA-079)	SLM/아민코	해당 사항 없음
헴스	시그마 알드리치	H3375
염화마그네슘	시그마 알드리치	M8266
멀티트론 쉐이킹 인큐베이터	인포어 HT	해당 사항 없음
수산화칼륨	피셔 케미칼	M16050
시스테인 감소	MP 생화학	101444
소르비톨	시그마 알드리치	S3889
자당	시그마 알드리치	S9378
시네코시스티스 sp. PCC 6803	해당 사항 없음	해당 사항 없음
Optima MAX-TL 초원심분리기	베크만 쿨터	A95761