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1. 액체 배양에서 살아있는 박테리아에 벌레 먹이 주기
메모: 이 프로토콜은 액체 배양에서 잘 혼합된 조건에서 실험실에서 재배한 박테리아로 벌레를 식민지화하는 데 사용됩니다. 벌레는 순수 배양(예: Enterococcus faecium과 같은 병원체) 또는 분리주의 혼합물(예: 최소 마이크로바이옴 군집)의 개별 분리주로 집락화될 수 있습니다.
- 15mL 원뿔형 튜브에서 자당으로 세척된 동기화된 성충으로 시작합니다. 웜을 12mL의 S 완충액으로 한 번 세척하고 상청액을 버립니다.
- 세척된 웜을 실험에 필요한 S 배지의 부피에 재현탁합니다. 실험 조건의 양, 벌레가 분할될 조건의 수, 벌레와 박테리아의 최종 농도를 고려하십시오.
메모: 벌레의 먹이는 박테리아 가용성에 따라 다르며 벌레는 밀집으로 인해 스트레스를 받을 수 있습니다. 액체 배양에서 집락화를 위해서는 <1000 웜/mL 및 >107 CFU/mL가 권장됩니다. 1011 CFU/mL는 대장균에 대한 "임의" 먹이 밀도로 간주됩니다. - 박테리아 배양을 스핀다운합니다. 상층액을 붓습니다. 흡인 또는 피펫팅을 사용하여 느슨한 펠릿을 형성하는 박테리아의 상청액을 제거할 수 있습니다.
메모: 배양 >5mL의 경우 15mL 튜브로 옮기고 대형 탁상용 원심분리기에서 ~2800 x g 로 8-10분 동안 회전시킵니다. 배양액 <5mL를 1.5mL 튜브로 옮기고 소형 탁상용 원심분리기에서 1-2분 동안 9000 x g 으로 원심분리할 수 있습니다. 운동성이 높은 박테리아(예: 많은 종의 슈도모나스)는 안정적인 펠릿 형성을 촉진하기 위해 4°C에서 10-15분 동안 냉각해야 할 수 있으며 4°C에서 원심분리하는 것이 더 나을 수 있습니다. - 박테리아 배양액을 한 부피의 S 완충액에 재현탁하고 다시 원심분리하여 펠릿화합니다. 이전과 같이 상청액을 제거하고 버립니다.
- 박테리아 배양물을 실험을 위해 원하는 밀도로 S 배지에 재현탁하고 선택을 위한 항생제를 첨가합니다. 사용할 항생제가 있는 경우 집락화에 사용되는 박테리아의 내성 프로필에 따라 달라집니다.
- 0.01% Triton X-100(M9TX-01)이 보충된 M9 웜 완충액으로 코팅된 피펫 팁을 사용하여 웜이 S 배지에 완전히 재현탁될 때까지 웜을 위아래로 부드럽게 피펫한 다음 박테리아 집락화를 위해 튜브 또는 플레이트 웰로 옮깁니다.
- 원하는 박테리아 농도와 최종 부피에 도달하기 위해 각 벌레 배양에 박테리아 현탁액을 첨가합니다.
- 식민지화를 위해 멀티웰 플레이트를 사용하는 경우 멸균 96웰 가스 투과성 밀봉 멤브레인으로 플레이트를 덮습니다.
- 배양 중에 박테리아가 침전되는 것을 방지하기 위해 200RPM에서 흔들면서 배양합니다.
2. 96웰 형식의 개별 웜의 기계적 파괴
메모: 이 섹션에서는 개별 박테리아 식민지화된 C. elegans의 기계적 파괴를 위한 96웰 플레이트 형식 프로토콜에 대해 설명합니다. 프로토콜의 첫 번째 단계는 벌레 장에서 부착되지 않은 박테리아를 제거하고 냉찜질 및 표면 표백을 사용하여 벌레의 외부를 청소하는 방법을 설명합니다. 이러한 단계는 박테리아 함량의 정량화를 위해 기계적으로 파괴하거나 추가 실험에 사용할 수 있는 깨끗하고 살아있는 성충을 생산합니다. 이 프로토콜은 액체 배양, 한천 플레이트 또는 자연 또는 소우주 토양에 식민지화된 벌레의 박테리아를 정량화하는 데 적용될 수 있습니다.
- M9TX-01의 분취량을 얼음 위에 놓아 식힙니다(mL 단위의 샘플 수의 4-5배).
- M9TX-01 + 표백제(6% 차아염소산나트륨, 1:1000 또는 1:2000v/v, 샘플당 1mL + 1mL 추가)의 분취량을 준비하고 얼음 위에 올려 식힙니다.
- 각 웜 샘플을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 있는 1mL의 M9TX-01에 재현탁합니다.
- 25°C에서 저속 소형 원심분리기(2,000 x g)에서 튜브를 짧게(2-3초) 회전시켜 성인을 펠릿화합니다. 상층액을 피펫팅하고 벌레 펠릿을 방해하지 않도록 버립니다.
- 원심분리를 사용하여 벌레를 1mL의 M9TX-01로 두 번 헹구고 1mL의 M9 벌레 완충액으로 한 번 헹구어 외부 박테리아를 줄입니다.
- 벌레 장에서 부착되지 않은 박테리아를 제거합니다.
- 배양 튜브에서 1mL의 S 배지 + 2x 열사멸 OP50에 각 웜 샘플을 재현탁합니다.
- 25°C에서 20-30분 동안 배양하여 장에서 부착되지 않은 박테리아가 통과할 수 있도록 합니다.
메모: 이것은 또한 내강에서 세포외 형광 단백질을 제거하고 특히 항산성 형광단(예: mCherry, dsRed)을 사용할 때 장 상피에 부착된 표지된 박테리아를 보다 명확하게 시각화할 수 있습니다.
- 외부 박테리아를 제거하기 위해 표면 표백제 벌레.
- 퍼지된 웜을 1mL의 차가운 M9TX-01로 두 번 헹구고 상청액을 버립니다.
- 튜브를 얼음(선호) 또는 4°C에서 10분 동안 식힙니다. 이렇게 하면 벌레가 마비되고 표백제 섭취를 방지할 수 있습니다.
메모: 다른 프로토콜은 레바미솔과 같은 화학적 마비제를 사용합니다. 이는 유해 폐기물 흐름을 추가해야 하는 확립된 접근 방식입니다. - 얼음처럼 차가운 M9 웜 완충액 1mL + 무향 표백제(8.25% 수산화나트륨, 1:1000 또는 1:2000 v/v)를 각 튜브에 추가합니다. 외부 박테리아를 죽이기 위해 튜브를 얼음 위(선호) 또는 4°C에서 최소 10분 동안 그대로 둡니다.
메모: 표백제의 농도는 1:1000을 초과하지 마십시오. 마비된 벌레에서도 사망에 이를 수 있습니다. - 표백제 완충액을 피펫팅하고 폐기하십시오. 표백제가 제거될 때까지 벌레가 펌핑을 재개하지 않도록 튜브를 얼음으로 되돌립니다.
- 각 튜브에 차가운 M9TX-01 1mL를 추가합니다. 미니 원심분리기(25°C에서 2,000 x g )에서 ~5초 동안 회전합니다. 튜브를 얼음으로 되돌립니다. 상청액을 제거하고 버립니다.
- 차가운 M9TX-01 1mL를 더 넣고 이 헹굼 단계를 반복하고 가능한 한 많은 상청액을 버립니다.