무균 C . elegans에서 장내 세균 집락화 평가

초록

출처: Taylor, MN, et.al. 단일 웜 데이터를 사용하여 Caenorhabditis elegans-박테리아 상호 작용의 이질성을 정량화합니다. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 무균, 연령 일치 Caenorhabditis elegans 벌레가 장 집락화를 위해 박테리아 균주에 노출되는 것을 보여줍니다. 부착되지 않은 외부 박테리아를 선택적으로 제거하여 정량화를 위해 장 상피에 부착된 생존 가능한 박테리아만 남기는 것을 설명합니다.

프로토콜

1. 액체 배양에서 살아있는 박테리아에 벌레 먹이 주기

메모: 이 프로토콜은 액체 배양에서 잘 혼합된 조건에서 실험실에서 재배한 박테리아로 벌레를 식민지화하는 데 사용됩니다. 벌레는 순수 배양(예: Enterococcus faecium과 같은 병원체) 또는 분리주의 혼합물(예: 최소 마이크로바이옴 군집)의 개별 분리주로 집락화될 수 있습니다.

1. 15mL 원뿔형 튜브에서 자당으로 세척된 동기화된 성충으로 시작합니다. 웜을 12mL의 S 완충액으로 한 번 세척하고 상청액을 버립니다.
2. 세척된 웜을 실험에 필요한 S 배지의 부피에 재현탁합니다. 실험 조건의 양, 벌레가 분할될 조건의 수, 벌레와 박테리아의 최종 농도를 고려하십시오.
   메모: 벌레의 먹이는 박테리아 가용성에 따라 다르며 벌레는 밀집으로 인해 스트레스를 받을 수 있습니다. 액체 배양에서 집락화를 위해서는 <1000 웜/mL 및 >10⁷ CFU/mL가 권장됩니다. 10¹¹ CFU/mL는 대장균에 대한 "임의" 먹이 밀도로 간주됩니다.
3. 박테리아 배양을 스핀다운합니다. 상층액을 붓습니다. 흡인 또는 피펫팅을 사용하여 느슨한 펠릿을 형성하는 박테리아의 상청액을 제거할 수 있습니다.
   메모: 배양 >5mL의 경우 15mL 튜브로 옮기고 대형 탁상용 원심분리기에서 ~2800 x g 로 8-10분 동안 회전시킵니다. 배양액 <5mL를 1.5mL 튜브로 옮기고 소형 탁상용 원심분리기에서 1-2분 동안 9000 x g 으로 원심분리할 수 있습니다. 운동성이 높은 박테리아(예: 많은 종의 슈도모나스)는 안정적인 펠릿 형성을 촉진하기 위해 4°C에서 10-15분 동안 냉각해야 할 수 있으며 4°C에서 원심분리하는 것이 더 나을 수 있습니다.
4. 박테리아 배양액을 한 부피의 S 완충액에 재현탁하고 다시 원심분리하여 펠릿화합니다. 이전과 같이 상청액을 제거하고 버립니다.
5. 박테리아 배양물을 실험을 위해 원하는 밀도로 S 배지에 재현탁하고 선택을 위한 항생제를 첨가합니다. 사용할 항생제가 있는 경우 집락화에 사용되는 박테리아의 내성 프로필에 따라 달라집니다.
6. 0.01% Triton X-100(M9TX-01)이 보충된 M9 웜 완충액으로 코팅된 피펫 팁을 사용하여 웜이 S 배지에 완전히 재현탁될 때까지 웜을 위아래로 부드럽게 피펫한 다음 박테리아 집락화를 위해 튜브 또는 플레이트 웰로 옮깁니다.
7. 원하는 박테리아 농도와 최종 부피에 도달하기 위해 각 벌레 배양에 박테리아 현탁액을 첨가합니다.
8. 식민지화를 위해 멀티웰 플레이트를 사용하는 경우 멸균 96웰 가스 투과성 밀봉 멤브레인으로 플레이트를 덮습니다.
9. 배양 중에 박테리아가 침전되는 것을 방지하기 위해 200RPM에서 흔들면서 배양합니다.

2. 96웰 형식의 개별 웜의 기계적 파괴

메모: 이 섹션에서는 개별 박테리아 식민지화된 C. elegans의 기계적 파괴를 위한 96웰 플레이트 형식 프로토콜에 대해 설명합니다. 프로토콜의 첫 번째 단계는 벌레 장에서 부착되지 않은 박테리아를 제거하고 냉찜질 및 표면 표백을 사용하여 벌레의 외부를 청소하는 방법을 설명합니다. 이러한 단계는 박테리아 함량의 정량화를 위해 기계적으로 파괴하거나 추가 실험에 사용할 수 있는 깨끗하고 살아있는 성충을 생산합니다. 이 프로토콜은 액체 배양, 한천 플레이트 또는 자연 또는 소우주 토양에 식민지화된 벌레의 박테리아를 정량화하는 데 적용될 수 있습니다.

1. M9TX-01의 분취량을 얼음 위에 놓아 식힙니다(mL 단위의 샘플 수의 4-5배).
2. M9TX-01 + 표백제(6% 차아염소산나트륨, 1:1000 또는 1:2000v/v, 샘플당 1mL + 1mL 추가)의 분취량을 준비하고 얼음 위에 올려 식힙니다.
3. 각 웜 샘플을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 있는 1mL의 M9TX-01에 재현탁합니다.
4. 25°C에서 저속 소형 원심분리기(2,000 x g)에서 튜브를 짧게(2-3초) 회전시켜 성인을 펠릿화합니다. 상층액을 피펫팅하고 벌레 펠릿을 방해하지 않도록 버립니다.
5. 원심분리를 사용하여 벌레를 1mL의 M9TX-01로 두 번 헹구고 1mL의 M9 벌레 완충액으로 한 번 헹구어 외부 박테리아를 줄입니다.
6. 벌레 장에서 부착되지 않은 박테리아를 제거합니다.
   1. 배양 튜브에서 1mL의 S 배지 + 2x 열사멸 OP50에 각 웜 샘플을 재현탁합니다.
   2. 25°C에서 20-30분 동안 배양하여 장에서 부착되지 않은 박테리아가 통과할 수 있도록 합니다.
      메모: 이것은 또한 내강에서 세포외 형광 단백질을 제거하고 특히 항산성 형광단(예: mCherry, dsRed)을 사용할 때 장 상피에 부착된 표지된 박테리아를 보다 명확하게 시각화할 수 있습니다.
7. 외부 박테리아를 제거하기 위해 표면 표백제 벌레.
   1. 퍼지된 웜을 1mL의 차가운 M9TX-01로 두 번 헹구고 상청액을 버립니다.
   2. 튜브를 얼음(선호) 또는 4°C에서 10분 동안 식힙니다. 이렇게 하면 벌레가 마비되고 표백제 섭취를 방지할 수 있습니다.
      메모: 다른 프로토콜은 레바미솔과 같은 화학적 마비제를 사용합니다. 이는 유해 폐기물 흐름을 추가해야 하는 확립된 접근 방식입니다.
   3. 얼음처럼 차가운 M9 웜 완충액 1mL + 무향 표백제(8.25% 수산화나트륨, 1:1000 또는 1:2000 v/v)를 각 튜브에 추가합니다. 외부 박테리아를 죽이기 위해 튜브를 얼음 위(선호) 또는 4°C에서 최소 10분 동안 그대로 둡니다.
      메모: 표백제의 농도는 1:1000을 초과하지 마십시오. 마비된 벌레에서도 사망에 이를 수 있습니다.
   4. 표백제 완충액을 피펫팅하고 폐기하십시오. 표백제가 제거될 때까지 벌레가 펌핑을 재개하지 않도록 튜브를 얼음으로 되돌립니다.
   5. 각 튜브에 차가운 M9TX-01 1mL를 추가합니다. 미니 원심분리기(25°C에서 2,000 x g )에서 ~5초 동안 회전합니다. 튜브를 얼음으로 되돌립니다. 상청액을 제거하고 버립니다.
   6. 차가운 M9TX-01 1mL를 더 넣고 이 헹굼 단계를 반복하고 가능한 한 많은 상청액을 버립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
표백제, 상업용, 차아염소산나트륨 8.25%	클로록스
염화칼슘 이수화물	피셔 사이언티픽	AC423525000
콜레스테롤	VWR	AAA11470-30
구연산 일수화물	피셔 사이언티픽	AC124910010
황산구리(II) 오수화물	피셔 사이언티픽	AC197722500
Corning 6765 LSE 미니 마이크로 원심분리기	코 닝	코르-6765
Eppendorf 1.5 mL 미세 원심분리기 튜브, 천연	에펜도르프
Eppendorf 5424R 마이크로 원심 분리기	에펜도르프	5406000640	24개 설치 냉장 벤치탑 마이크로 원심분리기
로터 S-4-104가 있는 Eppendorf 5810R 원심분리기	에펜도르프	22627040	15-50 mL 튜브 및 플레이트용 어댑터가 있는 3L 벤치탑 원심분리기
Eppendorf 플레이트 버킷(x2), 로터 S-4-104용	에펜도르프	22638930
에탄올 100%	피셔 사이언티픽	BP2818500
황산철(II) 칠수화물	피셔 사이언티픽	423731000
황산마그네슘 칠수화물	피셔 사이언티픽	AC124900010
염화망간(II) 사수화물	VWR	470301-706
펩톤	피셔 사이언티픽	BP1420-500
인완충 식염수(1X PBS)	골드 바이오	P-271-200
폴리프로필렌 오토클레이브 트레이, 얕은	피셔 사이언티픽	13-361-10
수산화칼륨	피셔 사이언티픽	AC134062500
인산이염기성 칼륨	피셔 사이언티픽	BP363-1
인산칼륨 일염기성	피셔 사이언티픽	BP362-1
국자형 실험실 주걱, 금속	VWR	470149-438
수산화나트륨	VWR	BDH7247-1
인산이염기성 나트륨 무수	피셔 사이언티픽	BP332-500
염화나트륨	피셔 사이언티픽	BP358-1
구연산삼칼륨 일수화물	피셔 사이언티픽	AC611755000
트리톤 X-100	피셔 사이언티픽	BP151-100
황산아연 칠수화물	피셔 사이언티픽	AC205982500