숙주-박테리아 상호 작용의 가변성을 평가하기 위한 개별 벌레의 기계적 파괴

초록

출처: Taylor, M. N. et al. 단일 웜 데이터를 사용하여 Caenorhabditis elegans-박테리아 상호 작용의 이질성을 정량화합니다. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 기계적 파괴를 통해 개별 Caenorhabditis elegans 의 장내 세균 부하 변동성을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 개별 벌레 간의 장내 박테리아 부하 차이를 평가하기 위한 샘플 준비, 기계적 파괴, 연속 희석 및 콜로니 계수 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. 기계적 파괴를 위해 탄화규소 입자가 있는 깊은 96웰 플레이트에 웜을 분리합니다. 다음과 같이 96웰 파괴 플레이트를 준비합니다.
   1. 멸균 2mL 딥웰 96웰 플레이트와 일치하는 실리콘 96웰 플레이트 커버를 얻습니다.
      메모: 조직 파괴기용 96웰 어댑터와 호환되는 플레이트를 사용하는 것이 중요합니다. 외부 치수의 작은 차이로 인해 어댑터에서 제거할 수 있는 플레이트와 제거할 수 없는 플레이트의 차이가 생깁니다.
   2. 멸균 스쿱 주걱을 사용하여 벌레를 수용할 플레이트의 각 웰에 소량의 멸균 36방 탄화규소를 추가합니다. 우물 바닥을 간신히 덮을 수 있을 만큼 충분한 모래를 사용하십시오(우물당 약 0.2g). 과도한 물질은 내용물을 회수할 때 피펫 팁을 우물 바닥으로 가져가기가 어렵게 만듭니다.
   3. 각 웰에 180μL의 M9 웜 완충액을 추가합니다.
   4. 각 샘플이 어디로 갈지 표시하기 위해 열 또는 행에 레이블을 붙인 다음 실리콘 96웰 플레이트 커버로 플레이트를 느슨하게 덮습니다.
2. 파괴를 위해 개별 웜을 96웰 플레이트로 옮깁니다.
   1. 투과화된 웜을 0.01% Triton X-100(M9TX-01)이 보충된 충분한 M9 웜 완충액이 들어 있는 작은(35mm 또는 60mm) 페트리 접시로 조심스럽게 이동하여 접시를 ~1cm 깊이까지 채웁니다.
      메모: 많은 수의 웜이 존재하는 경우 액체가 빽빽해지고 개별 웜을 피펫팅하기 어렵기 때문에 전체 샘플을 옮기는 것이 불가능할 수 있습니다.
   2. 해부 현미경 또는 기타 저배율 장치를 사용하여 20μL 부피의 개별 웜을 피펫팅하고 이러한 웜을 96웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다.
      메모: 갓 죽인 벌레만 수확하는 것이 가장 좋습니다. 단단하고 선형적인 벌레는 한동안 죽었을 수 있으므로 피하십시오. 정상적인 육체적 생리와 온전한 장을 가진 구부러진 또는 S자형 벌레를 섭취하십시오.
   3. 각 볼륨을 전송한 후 선택한 웜이 실제로 웰로 배출되었는지 확인합니다. 이를 위해 페트리 접시의 깨끗한 영역에서 20μL의 M9TX-01을 피펫팅하고 전체 부피를 접시에 다시 방출합니다. 이것은 일반적으로 웜이 피펫에 달라붙어 있으면 배출됩니다. 웜이 붙어 있는 경우 웰에서 20μL를 제거하고 다시 옮겨 보십시오.
   4. 모든 웜이 옮겨지면 96웰 플레이트를 시중에서 판매되는 유연한 종이 뒷면 밀봉 필름(2 x 2 정사각형) 시트로 덮고 밀봉 필름의 종이 뒷면이 샘플 웰에 아래를 향하도록 합니다. 밀봉 필름을 너무 얇게 늘리지 않도록 주의하지 않으면 나중에 제거하기가 매우 어려울 수 있습니다.
   5. 유연한 밀봉 필름 위에 실리콘 밀봉 매트를 가볍게 놓습니다. 이때 덮개를 우물에 밀어 넣지 마십시오.
   6. 플레이트를 4°C로 이동하여 30-60분 동안 식힙니다. 이렇게 하면 중단 중 과열을 방지하여 샘플을 손상시킬 수 있습니다.
      메모: 이는 프로토콜의 중단점입니다. 대부분의 경우 플레이트는 분쇄하기 전에 최대 4시간 동안 4°C에서 방치할 수 있습니다. 박테리아 수가 변경되므로 벌레를 밤새 방치하지 마십시오.
3. 96웰 플레이트를 조직 교란기에 로드하여 벌레 조직을 분해하고 장내 세균을 방출합니다.
   참고: (선택 사항) 분해를 위해 홀수 수의 96웰 플레이트를 사용하는 경우 진행하기 전에 균형추를 준비해야 합니다. 빈 깊은 96웰 플레이트를 사용하고 첫 번째 플레이트와 같은 무게가 될 때까지 웰에 물을 채웁니다.
   1. 실리콘 밀봉 매트를 웰에 단단히 눌러 밀봉을 만들고 뚜껑이 플레이트 전체 표면에 평평하게 놓이도록 합니다.
      메모: 연신 후 유연한 밀봉 필름이 너무 두꺼우면 실리콘 뚜껑을 고정하여 모든 우물에 평평하게 놓이기가 어렵습니다. 이로 인해 밀봉이 불충분하고 흔들리는 동안 웰 투 웰 오염이 발생합니다.
   2. 96웰 플레이트 어댑터를 사용하여 조직 파괴기에 플레이트를 고정합니다. 플레이트를 30Hz에서 1분 동안 흔든 다음 플레이트를 180° 회전하고 다시 1분 동안 흔듭니다. 이렇게 하면 플레이트의 모든 웰에서 균일한 중단을 보장하는 데 도움이 됩니다.
   3. 플레이트를 벤치에 두세 번 단단히 두드려 유연한 밀봉 필름에서 모래를 제거합니다.
   4. 두 개의 96웰 플레이트 어댑터가 있는 대형 원심분리기를 사용하여 플레이트를 2400 x g 으로 2분 동안 아래로 회전시켜 모든 물질을 웰 바닥으로 모으십시오.
   5. 실리콘 뚜껑을 제거하고 유연한 밀봉 필름을 조심스럽게 떼어냅니다.
      메모: 유연한 밀봉 필름이 웰에 달라붙으면 200μL 피펫 팁을 사용하여 제거합니다. 이는 유연한 밀봉 필름이 너무 얇게 늘어날 때 일반적입니다.
4. 96웰 플레이트에서 300μL로 벌레 분해 샘플을 연속적으로 희석합니다.
   1. 200μL로 설정된 멀티웰 피펫터를 사용하여 천천히 조심스럽게 위아래로 여러 번 피펫팅하여 웰의 내용물을 다시 혼합한 다음 가능한 한 많은 액체를 빼냅니다. 이 액체를 파괴된 웜 샘플의 연속 희석을 위해 준비된 96웰 플레이트의 맨 윗줄로 옮깁니다.
   2. 20μL로 설정된 96웰 피펫터를 사용하여 맨 윗줄에서 이 부피의 액체를 제거하고 B 행에 분배합니다. 위아래로 8-10회 피펫팅하여 혼합합니다. 팁을 버리십시오.
   3. 4.2단계를 반복하여 B 행의 0.1x 샘플부터 시작하여 C 행에 0.01x 희석 샘플을 생성합니다.
   4. 4.2단계를 다시 반복하여 C행에서 D행으로 이동합니다.
   5. 박테리아 정량화를 위해 고체 한천에 플레이트합니다. 단일 식민지화 벌레의 경우, 일반적으로 한천 플레이트에 각 희석액[1x-0.001x]의 10-20μL 방울을 도금하는 것으로 충분합니다. 다종 식민지화의 경우, 100 μL를 10cm 한천 플레이트에 피펫팅하여 각 희석액을 개별적으로 플레이트합니다. 유리 도금 구슬을 사용하여 즉시 펴 바릅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 플레이트 씰링 매트, 실리콘, 사각 웰(AxyMat)	액시젠	AM-2ML-SQ
96-웰 플레이트, 2 mL, 사각 웰	액시젠	P-2ML-SQ-C-S
96웰 폴리프로필렌 플레이트 뚜껑	에버그린 실험기구	290-8020-03L
한천	피셔 사이언티픽	443570050
96웰 플레이트용 비드 밀 어댑터 세트	키아겐	119900	TissueLyser II의 96웰 플레이트 2개와 함께 사용하기 위한 어댑터 플레이트
비드 밀 티슈 균질화기 (TissueLyser II)	키아겐	85300	중간 처리량 및 고처리량 시료 파괴를 위한 기계식 균질화기
Breathe-Easy 96웰 가스 투과성 밀봉 멤브레인	다각화된 생명공학	BEM-1	멀티웰 플레이트 가스 투과성 폴리우레탄 멤브레인. 얇은 밀봉 필름은 O₂, CO₂ 및 수증기에 투과성이 있으며 300nm까지 UV 투명합니다. 멸균, 100/상자.
로터 S-4-104가 있는 Eppendorf 5810R 원심분리기	에펜도르프	22627040	15-50 mL 튜브 및 플레이트용 어댑터가 있는 3L 벤치탑 원심분리기
Eppendorf 플레이트 버킷(x2), 로터 S-4-104용	에펜도르프	22638930
페트리 접시, 원형, 10cm	VWR	25384-094